Denne artikkelen beskriver to fenotypingsmetoder uten bruk av epidermal peeling for å karakterisere genene som styrer stomatal utvikling. Den første metoden demonstrerer hvordan man analyserer en stomatal fenotype ved hjelp av en toluidinblå O-farget planteepidermis. Den andre metoden beskriver hvordan man identifiserer stomatale ligander og overvåker deres biologiske aktiviteter.
Stomata er små porer på overflaten av landplanter som er involvert i gassutveksling og vanndamputslipp, og deres funksjon er kritisk for planteproduktivitet og overlevelse. Som sådan har forståelse av mekanismene som stomata utvikler seg og mønster enorm agronomisk verdi. Denne artikkelen beskriver to fenotypiske metoder ved bruk av Arabidopsis cotyledoner som kan brukes til å karakterisere genene som styrer stomatal utvikling og mønster. Presentert først er prosedyrer for analyse av stomatale fenotyper ved bruk av toluidinblå O-fargede cotyledoner. Denne metoden er rask og pålitelig og krever ikke bruk av epidermale peeling, som er mye brukt for fenotypiske analyser, men krever spesialisert opplæring. På grunn av tilstedeværelsen av flere cysteinrester har identifisering og generering av bioaktive EPF-peptider som har en rolle i stomatal utvikling vært utfordrende. Dermed presenteres andre er en prosedyre som brukes til å identifisere stomatale ligander og overvåke deres biologiske aktivitet ved bioassay. Den største fordelen med denne metoden er at den produserer reproduserbare data relativt enkelt, samtidig som mengden peptidløsning reduseres og tiden som kreves for å karakterisere peptidenes rolle i å kontrollere stomatal mønster og utvikling. Samlet sett forbedrer disse veldesignede protokollene effektiviteten ved å studere potensielle stomatale regulatorer, inkludert cysteinrike sekretoriske peptider, som krever svært komplekse strukturer for deres aktivitet.
Riktig mønster og differensiering av plantestomata er avgjørende for deres funksjon i to grunnleggende biologiske prosesser, fotosyntese og transpirasjon, og håndheves av EPF-peptidsignalveier. I Arabidopsis kontrollerer tre utskilte cysteinrike peptider, EPF1, EPF2 og STOMAGEN / EPFL9, forskjellige aspekter av stomatal utvikling og oppfattes av celleoverflatereseptorkomponenter, inkludert ERECTA-familie reseptorkinaser (ER, ERL1 og ERL2), SERKs og TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Denne erkjennelsen fører deretter til nedregulering av transkripsjonsfaktorene som fremmer stomatal differensiering ved en MAPK-avhengig prosess11. Oppdagelsen av disse kjernestomatale genene oppnås først og fremst ved fenotypisk screening av mutanter som viser epidermale defekter. Denne artikkelen presenterer relativt enkle og effektive fenotypingsmetoder for å visualisere stomata og andre epidermale celler, som kreves for å identifisere og karakterisere potensielle gener som styrer stomatal mønster og differensiering.
Observasjonen av detaljene i planteepidermis har vanligvis blitt oppnådd ved å bruke epidermale peelinger med eller uten farging med et fargestoff som toluidinblå O (TBO) eller safranin12,13,14. Hovedutfordringen med disse metodene er imidlertid at de krever spesialisert trening for å skrelle bladepidermis uten å rive vevet og nøye observere og analysere mønsterdataene samtidig som man unngår bildene tatt fra forskjellige deler av bladet. Kjemiske behandlinger for å fjerne vevsprøvene med reagenser som kloralhydratbaserte clearingløsninger har også blitt mye brukt for et annet utvalg av biologiske materialer 8,15; Disse behandlingene genererer mye fenotypisk informasjon ved å gi bilder av høy kvalitet, men krever også bruk av farlige kjemikalier (f.eks. Formaldehyd, kloralhydrat). Denne artikkelen presenterer først en relativt enkel og praktisk fenotypingsmetode som produserer bilder som er tilstrekkelige for kvantitativ analyse, men krever ikke bruk av farlige kjemikalier og epidermale bladpeelinger for prøveprepareringen. En TBO-farget cotyledon epidermis er også ideell for studiet av stomatal utvikling fordi mangelen på trikomer og den mindre utviklingsgradienten i cotyledoner tillater enkel og traktabel tolkning av epidermale fenotyper.
Stomatale EPF-peptider tilhører gruppen av plantespesifikke, cysteinrike peptider som har relativt store modne størrelser og intramolekylære disulfidbindinger mellom konserverte cysteinrester. Korrekt konformasjonsfolding er kritisk for deres biologiske funksjon, men cysteinrike peptider, som produseres ved enten kjemisk syntese eller et heterologt rekombinasjonssystem, kan være inaktive og er en blanding av både riktig foldede og utfoldede peptider 3,7,16. Dermed har screening av bioaktive peptider som har en rolle i å kontrollere stomatal utvikling vært en svært utfordrende oppgave. Dette manuskriptet beskriver i tillegg et bioassay for bedre identifisering og karakterisering av bioaktive stomatale peptider. I denne metoden dyrkes Arabidopsis-frøplanter i en flerbrønnsplate som inneholder medier med og uten potensielle peptider i 6-7 dager. Deretter visualiseres cotyledon epidermis ved hjelp av et konfokalmikroskop. Generelt, for å tydelig visualisere den biologiske aktiviteten til potensielle peptider i stomatal utvikling, brukes genotypene som produserer flere og / eller mindre stomatale avstamningsceller, som epf2-mutanten, som produserer flere epidermale celler, og STOMAGEN-ami-linjen, som gir redusert epidermal celletetthet 2,4,5, i tillegg til villtype Arabidopsis-kontrollen (Col-0) for bioassayene.
Samlet sett kan de to protokollene som presenteres her brukes til rask og effektiv vurdering av ulike epidermale fenotyper og for screening av små peptider og hormoner som har en rolle i å kontrollere stomatal mønster og utvikling.
De to fenotypiske analysemetodene for å identifisere og karakterisere genene som kontrollerer stomatal mønster og differensiering presentert her, er praktiske og pålitelige analyser siden protokollene ikke krever bruk av epidermale peelinger og spesialutstyr (som er tidkrevende og krever spesiell trening for prøvepreparering), men produserer bilder av høy kvalitet for kvantitativ analyse av epidermale fenotyper.
En begrensning ved denne teknikken for fenotypisk analyse ved bruk av TBO-far…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert gjennom Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery-programmet og Concordia University. KB støttes av National Overseas Scholarship fra India.
18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
Agar | BioShop | AGR001.1 | |
Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |