Este trabalho descreve dois métodos de fenotipagem sem o uso de cascas epidérmicas para caracterizar os genes que controlam o desenvolvimento estomatizante. O primeiro método demonstra como analisar um fenótipo estomatal usando uma epiderme vegetal corada com O azul de toluidina . O segundo método descreve como identificar ligantes estomatáticos e monitorar suas atividades biológicas.
Os estomatos são pequenos poros na superfície das plantas terrestres que estão envolvidos na troca gasosa e na liberação de vapor de água, e sua função é crítica para a produtividade e sobrevivência das plantas. Como tal, a compreensão dos mecanismos pelos quais os estômatos se desenvolvem e padronizam tem um tremendo valor agronômico. Este trabalho descreve dois métodos fenotípicos utilizando Arabidopsis cotyledons que podem ser usados para caracterizar os genes que controlam o desenvolvimento estomático e a padronização. Primeiramente são apresentados os procedimentos para análise dos fenótipos estomatáticos utilizando cotilédones corados com azul de toluidina O. Este método é rápido e confiável e não requer o uso de peelings epidérmicos, que são amplamente utilizados para análises fenotípicas, mas exigem treinamento especializado. Devido à presença de múltiplos resíduos de cisteína, a identificação e geração de peptídeos EPF bioativos que têm um papel no desenvolvimento estomático têm sido desafiadores. Assim, apresenta-se em segundo lugar um procedimento utilizado para identificar ligantes estomatáticos e monitorar sua atividade biológica por bioensaios. A principal vantagem deste método é que ele produz dados reprodutíveis com relativa facilidade, reduzindo a quantidade de solução peptídica e o tempo necessário para caracterizar o papel dos peptídeos no controle do padrão estomático e desenvolvimento. No geral, esses protocolos bem projetados aumentam a eficiência do estudo dos potenciais reguladores estomáticos, incluindo peptídeos secretores ricos em cisteína, que exigem estruturas altamente complexas para sua atividade.
A padronização adequada e a diferenciação dos estômatos vegetais são críticas para sua função em dois processos biológicos fundamentais, fotossíntese e transpiração, e são impostas pelas vias de sinalização do peptídeo EPF. Na Arabidopsis, três peptídeos ricos em cisteína secretados, EPF1, EPF2 e STOMAGEN/EPFL9, controlam diferentes aspectos do desenvolvimento estomático e são percebidos pelos componentes do receptor da superfície celular, incluindo quinases receptoras da família ERECTA (ER, ERL1 e ERL2), SERKs e TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Esse reconhecimento, então, leva à regulação negativa dos fatores de transcrição que promovem a diferenciação estomática por um processo dependente de MAPK11. A descoberta desses genes estomatâmicos centrais é alcançada principalmente pela triagem fenotípica de mutantes que exibem defeitos epidérmicos. Este trabalho apresenta métodos de fenotipagem relativamente simples e eficientes para a visualização dos estômatos e outras células epidérmicas, que são necessários para identificar e caracterizar os genes potenciais que controlam a padronização e diferenciação estomática.
A observação dos detalhes da epiderme vegetal tem sido tipicamente realizada por meio de peelings epidérmicos com ou sem coloração com corante como azul de toluidina O (TBO) ou safranina12,13,14. No entanto, o principal desafio desses métodos é que eles exigem treinamento especializado para descascar a epiderme foliar sem rasgar os tecidos e observar e analisar cuidadosamente os dados de padronização, evitando as imagens retiradas de diferentes partes da folha. Tratamentos químicos para limpar as amostras de tecido com reagentes, como soluções de clareamento à base de hidrato de cloral, também têm sido amplamente utilizados para uma variedade de materiais biológicos 8,15; esses tratamentos geram uma grande quantidade de informações fenotípicas, fornecendo imagens de alta qualidade, mas também exigem o uso de produtos químicos perigosos (por exemplo, formaldeído, hidrato de cloral). Este artigo apresenta primeiro um método de fenotipagem relativamente fácil e conveniente que produz imagens suficientes para análise quantitativa, mas não requer o uso de produtos químicos perigosos e cascas de folhas epidérmicas para a preparação da amostra. Uma epiderme de cotilédones corada com TBO também é ideal para o estudo do desenvolvimento estomático, pois a falta de tricomas e o menor gradiente de desenvolvimento nos cotilédones permitem a interpretação simples e tratável dos fenótipos epidérmicos.
Os peptídeos estomáticos EPF pertencem ao grupo de peptídeos específicos de plantas, ricos em cisteína, que têm tamanhos maduros relativamente grandes e ligações dissulfeto intramoleculares entre resíduos de cisteína conservados. O correto dobramento conformacional é fundamental para sua função biológica, mas os peptídeos ricos em cisteína, que são produzidos por síntese química ou por um sistema de recombinação heteróloga, podem ser inativos e são uma mistura de peptídeos adequadamente dobrados e desdobrados 3,7,16. Assim, o rastreamento de peptídeos bioativos que têm um papel no controle do desenvolvimento estomático tem sido uma tarefa muito desafiadora. Este manuscrito descreve adicionalmente um bioensaio para a melhor identificação e caracterização de peptídeos estomáticos bioativos. Neste método, as mudas de Arabidopsis são cultivadas em uma placa de múltiplos poços contendo meios com e sem peptídeos potenciais por 6-7 dias. Em seguida, a epiderme do cotilédones é visualizada usando um microscópio confocal. Em geral, para visualizar claramente a atividade biológica de peptídeos potenciais no desenvolvimento estomático, os genótipos que produzem mais e/ou menos células estomáticas da linhagem, como o mutante epf2, que produz mais células epidérmicas, e a linhagem STOMAGEN-ami, que confere densidade celular epidérmica reduzida 2,4,5, são utilizados além do controle de Arabidopsis do tipo selvagem (Col-0) para os bioensaios.
No geral, os dois protocolos aqui apresentados podem ser utilizados para a avaliação rápida e eficiente de vários fenótipos epidérmicos e para o rastreamento de pequenos peptídeos e hormônios que têm um papel no controle do padrão estomático e do desenvolvimento.
Os dois métodos de análise fenotípica para identificar e caracterizar os genes que controlam a padronização e diferenciação estomática aqui apresentados são ensaios convenientes e confiáveis, uma vez que os protocolos não exigem o uso de peelings epidérmicos e equipamentos especializados (que são demorados e requerem treinamento especial para o preparo da amostra), mas produzem imagens de alta qualidade para a análise quantitativa dos fenótipos epidérmicos.
Uma limitação dess…
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi financiada através do programa de Descoberta do Conselho de Pesquisa de Recursos Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) e da Universidade de Concordia. K.B. é apoiado pela National Overseas Scholarship da Índia.
18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
Agar | BioShop | AGR001.1 | |
Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |