Identificación de los genes implicados en el desarrollo estomatológico mediante la puntuación del fenotipo epidérmico
Summary
Este artículo describe dos métodos de fenotipado sin el uso de peelings epidérmicos para caracterizar los genes que controlan el desarrollo estomatizante. El primer método demuestra cómo analizar un fenotipo estomatizado utilizando una epidermis vegetal teñida con azul de toluidina. El segundo método describe cómo identificar ligandos estomacales y monitorear sus actividades biológicas.
Abstract
Los estomas son pequeños poros en la superficie de las plantas terrestres que están involucrados en el intercambio de gases y la liberación de vapor de agua, y su función es crítica para la productividad y supervivencia de las plantas. Como tal, comprender los mecanismos por los cuales se desarrollan y modelan los estomas tiene un tremendo valor agronómico. Este artículo describe dos métodos fenotípicos utilizando Arabidopsis cotiledones que se pueden utilizar para caracterizar los genes que controlan el desarrollo estomático y el patrón. En primer lugar se presentan los procedimientos para analizar los fenotipos estomatizados utilizando cotiledones teñidos con azul de toluidina O. Este método es rápido y confiable y no requiere el uso de peelings epidérmicos, que son ampliamente utilizados para análisis fenotípicos pero requieren capacitación especializada. Debido a la presencia de múltiples residuos de cisteína, la identificación y generación de péptidos EPF bioactivos que tienen un papel en el desarrollo estomático ha sido un desafío. Por lo tanto, se presenta en segundo lugar un procedimiento utilizado para identificar ligandos estomatizados y monitorear su actividad biológica mediante bioensayos. La principal ventaja de este método es que produce datos reproducibles con relativa facilidad al tiempo que reduce la cantidad de solución peptídica y el tiempo requerido para caracterizar el papel de los péptidos en el control del patrón y desarrollo de los estomas. En general, estos protocolos bien diseñados mejoran la eficiencia del estudio de los posibles reguladores estomatales, incluidos los péptidos secretores ricos en cisteína, que requieren estructuras altamente complejas para su actividad.
Introduction
El patrón adecuado y la diferenciación de los estomas vegetales son críticos para su función en dos procesos biológicos fundamentales, la fotosíntesis y la transpiración, y son aplicados por las vías de señalización del péptido EPF. En Arabidopsis, tres péptidos ricos en cisteína secretados, EPF1, EPF2 y STOMAGEN/EPFL9, controlan diferentes aspectos del desarrollo estomatológico y son percibidos por los componentes del receptor de la superficie celular, incluidas las quinasas receptoras de la familia ELECC (ER, ERL1 y ERL2), SERKs y TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Este reconocimiento conduce entonces a la regulación a la baja de los factores de transcripción que promueven la diferenciación estomática por un proceso dependiente de MAPK11. El descubrimiento de estos genes estomatizados centrales se logra principalmente mediante el cribado fenotípico de mutantes que exhiben defectos epidérmicos. Este artículo presenta métodos de fenotipado relativamente simples y eficientes para visualizar los estomas y otras células epidérmicas, que son necesarios para identificar y caracterizar los genes potenciales que controlan el patrón y la diferenciación de los estomas.
La observación de los detalles de la epidermis vegetal se ha logrado típicamente mediante el uso de peelings epidérmicos con o sin tinción con un colorante como el azul de toluidina O (TBO) o la safranina12,13,14. Sin embargo, el principal desafío de estos métodos es que requieren capacitación especializada para pelar la epidermis de la hoja sin desgarrar los tejidos y para observar y analizar cuidadosamente los datos de patrones mientras se evitan las imágenes tomadas de diferentes partes de la hoja. Los tratamientos químicos para limpiar las muestras de tejido con reactivos como las soluciones de limpieza a base de hidrato de cloral también se han utilizado ampliamente para una amplia gama de materiales biológicos 8,15; Estos tratamientos generan una gran cantidad de información fenotípica al proporcionar imágenes de alta calidad, pero también requieren el uso de productos químicos peligrosos (por ejemplo, formaldehído, hidrato de cloral). Este documento presenta primero un método de fenotipado relativamente fácil y conveniente que produce imágenes suficientes para el análisis cuantitativo, pero no requiere el uso de productos químicos peligrosos y peelings de hojas epidérmicas para la preparación de la muestra. Una epidermis de cotiledón teñida con TBO también es ideal para el estudio del desarrollo estomatizado porque la falta de tricomas y el gradiente de desarrollo más pequeño en los cotiledones permiten la interpretación simple y manejable de los fenotipos epidérmicos.
Los péptidos EPF estomatizados pertenecen al grupo de péptidos ricos en cisteína específicos de plantas que tienen tamaños maduros relativamente grandes y enlaces disulfuro intramoleculares entre residuos de cisteína conservados. El plegamiento conformacional correcto es crítico para su función biológica, pero los péptidos ricos en cisteína, que se producen por síntesis química o por un sistema de recombinación heterólogo, pueden estar inactivos y son una mezcla de péptidos correctamente plegados y desplegados 3,7,16. Por lo tanto, la selección de péptidos bioactivos que tienen un papel en el control del desarrollo estomático ha sido una tarea muy difícil. Este manuscrito describe adicionalmente un bioensayo para la mejor identificación y caracterización de péptidos estomacales bioactivos. En este método, las plántulas de Arabidopsis se cultivan en una placa de múltiples pocillos que contiene medios con y sin péptidos potenciales durante 6-7 días. Luego, la epidermis de cotiledón se visualiza usando un microscopio confocal. En general, para visualizar claramente la actividad biológica de los péptidos potenciales en el desarrollo estomatal, se utilizan los genotipos que producen más y/o menos células de linaje estomatárico, como el mutante epf2, que produce más células epidérmicas, y la línea STOMAGEN-ami, que confiere una densidad celular epidérmica reducida 2,4,5, además del control de Arabidopsis de tipo salvaje (Col-0) para los bioensayos.
En general, los dos protocolos presentados aquí se pueden utilizar para la evaluación rápida y eficiente de varios fenotipos epidérmicos y para la detección de pequeños péptidos y hormonas que tienen un papel en el control del patrón y desarrollo de los estomas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los dos métodos de análisis fenotípico para identificar y caracterizar los genes que controlan el patrón estomatológico y la diferenciación presentados aquí son ensayos convenientes y confiables, ya que los protocolos no requieren el uso de peelings epidérmicos y equipos especializados (que requieren mucho tiempo y requieren capacitación especial para la preparación de muestras), pero producen imágenes de alta calidad para el análisis cuantitativo de fenotipos epidérmicos.
Una lim…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada a través del programa Discovery del Consejo de Investigación de Recursos Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) y la Universidad de Concordia. K.B. cuenta con el apoyo de la Beca Nacional de Ultramar de la India.
Materials
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
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