Stomatal Gelişimde Rol Oynayan Genlerin Epidermal Fenotip Skorlaması ile Tanımlanması
Summary
Bu yazıda stoma gelişimini kontrol eden genleri karakterize etmek için epidermal peeling kullanılmadan iki fenotipleme yöntemi anlatılmaktadır. İlk yöntem, toluidin mavisi O-boyalı bitki epidermisi kullanılarak stoma fenotipinin nasıl analiz edileceğini göstermektedir. İkinci yöntem, stoma ligandlarının nasıl tanımlanacağını ve biyolojik aktivitelerinin nasıl izleneceğini açıklar.
Abstract
Stomalar, gaz değişimi ve su buharı salınımında rol oynayan kara bitkilerinin yüzeyindeki küçük gözeneklerdir ve işlevleri bitki verimliliği ve hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, stomaların geliştiği mekanizmaları ve desenini anlamak muazzam bir agronomik değere sahiptir. Bu yazıda Arabidopsis kotiledonlarının kullanıldığı ve stoma gelişimini ve paternlemesini kontrol eden genleri karakterize etmek için kullanılabilecek iki fenotipik yöntem anlatılmaktadır. İlk olarak toluidin mavisi O-boyalı kotiledonlar kullanılarak stoma fenotiplerini analiz etmek için prosedürler sunulmuştur. Bu yöntem hızlı ve güvenilirdir ve fenotipik analizler için yaygın olarak kullanılan ancak özel eğitim gerektiren epidermal peelinglerin kullanılmasını gerektirmez. Multipl sistein kalıntılarının varlığı nedeniyle, stoma gelişiminde rol oynayan biyoaktif EPF peptitlerinin tanımlanması ve üretilmesi zor olmuştur. Bu nedenle, ikinci sunulan stoma ligandlarını tanımlamak ve biyolojik aktivitelerini biyotahlillerle izlemek için kullanılan bir prosedürdür. Bu yöntemin temel avantajı, peptid çözeltisinin miktarını ve peptidlerin stoma desenini ve gelişimini kontrol etmedeki rolünü karakterize etmek için gereken süreyi azaltırken, nispeten kolay bir şekilde tekrarlanabilir veriler üretmesidir. Genel olarak, bu iyi tasarlanmış protokoller, aktiviteleri için oldukça karmaşık yapılar gerektiren sistein bakımından zengin salgı peptitleri de dahil olmak üzere potansiyel stoma düzenleyicilerini incelemenin verimliliğini arttırır.
Introduction
Bitki stomalarının uygun şekilde modellenmesi ve farklılaşması, fotosentez ve terleme olmak üzere iki temel biyolojik süreçteki işlevleri için kritik öneme sahiptir ve EPF peptid sinyal yolları tarafından uygulanır. Arabidopsis’te, salgılanan üç sistein bakımından zengin peptit, EPF1, EPF2 ve STOMAGEN / EPFL9, stoma gelişiminin farklı yönlerini kontrol eder ve ERECTA-ailesi reseptör kinazları (ER, ERL1 ve ERL2), SERK’ler ve TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 dahil olmak üzere hücre yüzeyi reseptör bileşenleri tarafından algılanır. . Bu tanıma daha sonra MAPK’ya bağımlı bir süreç11 ile stoma farklılaşmasını teşvik eden transkripsiyon faktörlerinin aşağı regülasyonuna yol açar. Bu çekirdek stoma genlerinin keşfi öncelikle epidermal defekt sergileyen mutantların fenotipik taraması ile sağlanır. Bu yazıda, stoma paternini ve farklılaşmasını kontrol eden potansiyel genleri tanımlamak ve karakterize etmek için gerekli olan stomaların ve diğer epidermal hücrelerin görselleştirilmesi için nispeten basit ve etkili fenotipleme yöntemleri sunulmaktadır.
Bitki epidermisinin detaylarının gözlemlenmesi tipik olarak, toluidin mavisi O (TBO) veya safranin12,13,14 gibi bir boya ile lekelenmiş veya lekelenmemiş epidermal kabuklar kullanılarak elde edilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin temel zorluğu, yaprakları yırtmadan yaprak epidermisini soymak ve yaprağın farklı bölgelerinden alınan görüntülerden kaçınırken desen verilerini dikkatlice gözlemlemek ve analiz etmek için özel eğitim gerektirmesidir. Doku örneklerini kloral hidrat bazlı temizleme çözeltileri gibi reaktiflerle temizlemeye yönelik kimyasal işlemler, çeşitli biyolojik materyaller için de yaygın olarak kullanılmaktadır 8,15; Bu tedaviler, yüksek kaliteli görüntüler sağlayarak çok sayıda fenotipik bilgi üretir, ancak aynı zamanda tehlikeli kimyasalların (örneğin, formaldehit, kloral hidrat) kullanılmasını gerektirir. Bu yazıda ilk olarak, kantitatif analiz için yeterli görüntü üreten, ancak numune hazırlama için tehlikeli kimyasalların ve epidermal yaprak kabuklarının kullanılmasını gerektirmeyen nispeten kolay ve kullanışlı bir fenotipleme yöntemi sunulmaktadır. TBO boyalı kotiledon epidermisi stoma gelişiminin incelenmesi için de idealdir, çünkü trikomların eksikliği ve kotiledonlardaki daha küçük gelişimsel gradyan, epidermal fenotiplerin basit ve izlenebilir bir şekilde yorumlanmasına izin verir.
Stomatal EPF peptitleri, nispeten büyük olgun boyutlara ve korunmuş sistein kalıntıları arasındaki intramoleküler disülfit bağlarına sahip bitkiye özgü, sistein bakımından zengin peptitler grubuna aittir. Doğru konformasyonel katlama, biyolojik işlevleri için kritik öneme sahiptir, ancak kimyasal sentez veya heterolog bir rekombinasyon sistemi tarafından üretilen sistein bakımından zengin peptitler inaktif olabilir ve hem uygun şekilde katlanmış hem de katlanmamış peptitlerin bir karışımıdır 3,7,16. Bu nedenle, stoma gelişiminin kontrolünde rol oynayan biyoaktif peptitlerin taranması çok zorlu bir görev olmuştur. Bu makale ayrıca biyoaktif stoma peptitlerinin daha iyi tanımlanması ve karakterizasyonu için bir biyotahlil açıklamaktadır. Bu yöntemde, Arabidopsis fideleri 6-7 gün boyunca potansiyel peptitleri olan ve olmayan ortamlar içeren çok kuyucuklu bir plakada yetiştirilir. Daha sonra, kotiledon epidermisi konfokal mikroskop kullanılarak görselleştirilir. Genel olarak, stoma gelişiminde potansiyel peptitlerin biyolojik aktivitesini açıkça görselleştirmek için, daha fazla epidermal hücre üreten epf2 mutantı ve azalmış epidermalhücre yoğunluğu 2,4,5 veren STOMAGEN-ami hattı gibi az ya da çok stoma soy hücreleri üreten genotipler, biyotahliller için vahşi tip Arabidopsis kontrolüne (Col-0) ek olarak kullanılır.
Genel olarak, burada sunulan iki protokol, çeşitli epidermal fenotiplerin hızlı ve verimli bir şekilde değerlendirilmesi ve stoma paterninin ve gelişiminin kontrolünde rol oynayan küçük peptitlerin ve hormonların taranması için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan stoma paternleme ve farklılaşmayı kontrol eden genleri tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılan iki fenotipik analiz yöntemi, protokoller epidermal peelinglerin ve özel ekipmanların (zaman alıcı olan ve numune hazırlama için özel eğitim gerektiren) kullanılmasını gerektirmediğinden, ancak epidermal fenotiplerin kantitatif analizi için yüksek kaliteli görüntüler ürettiğinden, uygun ve güvenilir analizlerdir.
TBO boyalı Arabidopsis kotil…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Kanada Doğal Kaynaklar ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Keşif programı ve Concordia Üniversitesi tarafından finanse edilmiştir. K.B., Hindistan’dan Ulusal Denizaşırı Bursu tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1–A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
