改変自家馴化血清の作製とマウス角膜上皮における治癒能の ex vivo 評価
Summary
この記事では、プロセスを簡素化し、自家コンディショニング血清(ACS)の調製をより安価にするプロトコルについて説明します。特別な注射器や表面コーティングされたガラスビーズは必要ありません。さらに、修飾ACS(mACS)は、マウス眼の角膜創傷治癒において、 エキサイビボで従来の自家血清よりも競争上の優位性を有する。
Abstract
ヒト血液由来の局所療法は、ここ数十年で臨床医に恩恵をもたらしてきました。自家血清(AS)および多血小板血漿(PRP)は、角膜創傷治癒に不可欠な上皮向性成長因子が豊富に含まれています。ASとは異なり、PRPは差動遠心分離システムに基づいており、より多くの血小板由来成長因子を生成します。自家馴化血清(ACS)は、ASおよびPRPの調製を保存するだけでなく、炎症性疾患において重要な免疫調節特性にも焦点を当てています。
標準化されたプロトコルの欠如と高い準備コストは、ACSの臨床応用の限界です。このビデオ実験は、修正された自己条件化血清(mACS)点眼薬を調製するための標準的な操作手順を示しています。まず、低酸素インキュベーション中に血球安定剤としてグリセロールをヘパリン注射器に添加した。血球を活性化するために、37°Cで4時間のインキュベーションを開始した。その後、血液サンプルを室温で10分間3,500× g で遠心分離した。上清を0.22 μmのフィルターでろ過した後、mACS点眼薬を十分に調製しました。
mACSの治療効果の暫定的なトライアウトは、 それがex vivo マウス眼における角膜創傷治癒において従来のASよりも競争上の優位性を有する可能性があることを示した。本研究で用いたASは、公表された研究と当院での臨床診療に従って調製された。したがって、眼の表面疾患に対するmACSの有効性は、 in vivo 動物実験および臨床試験を通じて将来の研究で評価される可能性があります。
Introduction
ドライアイ疾患における自家血清(AS)の治療効果は、1980年代にFoxらによって最初に報告されました1。ASの潤滑特性と必須のエピテリオトロピック生化学的成分の両方が、天然の涙を模倣して、角膜上皮細胞の増殖に利益をもたらすと考えられています。過去数十年にわたって、これに基づいていくつかの研究が行われてきました。栄養成分には、上皮成長因子(EGF)、ビタミンA、トランスフォーミング成長因子β(TGF−β)、および他のサイトカインが含まれる。興味深いことに、血清にはTGF-βとビタミンAが豊富に含まれており、これらは表皮増殖に極めて重要な役割を果たしていると考えられています2,3,4,5。さらに、眼表面疾患の患者を治療する場合、いくつかの研究は、患者が報告した結果、他の客観的なドライアイパラメータ6,7、および細胞密度8などの顕微鏡所見におけるAS点眼薬のいくつかの利点を示しています。メタアナリシス研究では、AS点眼薬治療で患者の症候群を改善することにいくつかの利点があるかもしれないことが明らかになりましたが、長期的な結果と観察はまだ不足しています9,10。
ASとは異なり、多血小板血漿(PRP)は、調製中に抗凝固剤を添加することに由来し、血小板のさらなる差遠心分離と化学的活性化を伴う。ASと比較して、TGF-β、血管内皮成長因子(VEGF)、およびEGFなどの多数の化学物質および成長因子がPRPに存在する。また、症状緩和に臨床的利益をもたらす眼表面疾患にも適用されています11。
上皮欠損と炎症の間の架橋は複雑です。特に、免疫病態生理学は眼の表面疾患におけるもう一つの重要な問題である。IL-1βおよびIFN-γなどの炎症誘発性サイトカインは、炎症カスケードにおける極めて重要なメディエーターであると考えられている12。したがって、免疫メカニズムの理解に基づいて、新しい治療の道が開かれます。インターロイキン−1受容体アンタゴニスト(IL−1Ra)および他の抗炎症性サイトカインの産生を含むこの炎症過程を止めるための戦略もまた、眼表面疾患において重要な役割を果たす可能性がある13、14、15。
1998年以来、商品化された自家コンディショニング血清(ACS)であるオルソカインは、変形性関節症(OA)、関節リウマチ(RA)、および脊椎疾患に苦しむ整形外科患者に臨床的に使用されてきました13。ASおよびPRPと比較して、化学的にコーティングされたガラスビーズによる処理および単球を活性化するための低酸素インキュベーションは、ACS16の特徴です。理論的には、細胞に生存ストレスを加えることによってより多くの抗炎症因子が分泌され、その結果、IL-1Raを含む必須免疫調節成分の濃度が高くなります。ASと比較して、OAにおけるACSの治療効果の改善も報告されています17。眼表面疾患は、いくつかの点で整形外科炎症性疾患と同様の免疫背景を共有しています。したがって、整形外科分野でのヒト血液由来治療の成功結果に基づいて、ACSは、エピテリオトロピックおよび免疫調節特性によって、臨床診療における従来の治療よりも優れている可能性があります。ACSは整形外科の炎症性疾患で広く使用されていますが、眼科での臨床応用はまだ検討する必要があり、コストが高いこと、文献サポートの欠如、および調製プロセスの標準化の欠如によって妨げられる可能性があり、その結果、多様な性能が得られます。
このビデオ記事では、修飾ACS(mACS)、または成長因子に富む血漿(PRGF)を生成するための、新しく費用効果が高く、便利な方法が実証され、商品化されたACSに匹敵する実用的な価値を持つ点眼液が製造されました。抗凝固剤を添加し、ストレスインキュベーションによって血球に抗炎症性サイトカインを分泌させるという重要なアイデアは保持されましたが、CrSO4コーティングガラスビーズや市販キットに基づく方法などの化学的に誘発される方法とは異なり、臨界ストレス状態は低酸素インキュベーションによって物理的に誘発されますこの方法。さらに、グリセロールは、血球の膜の安定性の向上、適切な浸透圧細胞外液圧の維持18、および細胞に過度のストレスを避ける低酸素状態での適切な栄養源を含む追加の利点を提供するために添加されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究では、mACSの調製のためのプロトコルが説明され、動物モデルの創傷治癒におけるmACS点眼薬の利点がさらに示されています。このmACSプロトコルの重要な変更は、各試験管に約0.5 mLの10%グリセロール溶液を添加することであり、37°Cでの4時間のインキュベーション中に適切な低酸素状態を作り出します。 この設定は、ASに適切なストレスを与え、細胞が創傷治癒を助けるために必要な?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、優れた技術支援を提供してくれたYa-Lan ChienとChia-Ying Lee、そして言語版を提供してくれたOnLine English社に感謝します。この研究の一部は、Chang Gung Medical Research Project(助成金番号CMRPG3L1491)によって資金提供されました。
Materials
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
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