Producción de suero condicionado autólogo modificado y evaluación ex vivo de su potencial curativo en el epitelio corneal murino
Summary
Este artículo describe un protocolo para simplificar el proceso y hacer que la preparación de suero condicionado autólogo (SCA) sea menos costosa. No se necesitan jeringas especiales ni perlas de vidrio recubiertas superficialmente. Además, el SCA modificado (mACS) tiene ventajas competitivas sobre el suero autólogo convencional en la cicatrización de heridas corneales de ojos murinos ex vivo.
Abstract
Las terapias tópicas derivadas de la sangre humana han sido una bendición para los médicos en las últimas décadas. El suero autólogo (EA) y el plasma rico en plaquetas (PRP) están enriquecidos en factores de crecimiento epiteliotrópicos que son esenciales en la cicatrización de heridas corneales. A diferencia de AS, PRP se basa en un sistema de centrifugación diferencial, produciendo más factores de crecimiento derivados de plaquetas. El suero autólogo condicionado (SCA) no solo preserva la preparación de AS y PRP, sino que también se centra en las propiedades inmunomoduladoras, que son importantes en las enfermedades inflamatorias.
La falta de protocolos estandarizados y los altos costos de preparación son limitaciones para la aplicación clínica de SCA. Este experimento en video demuestra un procedimiento operativo estándar para preparar gotas oftálmicas modificadas de suero autólogo condicionado (mACS). Primero, se agregó glicerol en jeringas de heparina como estabilizador de células sanguíneas durante la incubación hipóxica. Para activar las células sanguíneas, se inició una incubación de 4 h a 37 °C. Luego, las muestras de sangre se centrifugaron a 3.500 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la filtración del sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm, las gotas oftálmicas mACS se prepararon completamente.
Una prueba tentativa del efecto terapéutico de mACS mostró que puede tener ventajas competitivas sobre la EA convencional en la cicatrización de heridas corneales en ojos de ratón ex vivo . La EA utilizada en este estudio fue preparada de acuerdo con los estudios publicados y la práctica clínica en nuestro hospital. Por lo tanto, la eficacia de mACS en enfermedades de la superficie ocular podría evaluarse en futuras investigaciones a través de estudios in vivo en animales y ensayos clínicos.
Introduction
Los efectos terapéuticos del suero autólogo (EA) en las enfermedades del ojo seco fueron reportados por primera vez en la década de 1980 por Fox et al.1. Se cree que tanto la propiedad lubricante como los componentes bioquímicos epiteliotrópicos esenciales en la EA, imitando las lágrimas naturales, benefician la proliferación de células epiteliales corneales. En las últimas décadas, se han realizado varios estudios sobre esta base. Los componentes tróficos incluyen factor de crecimiento epidérmico (EGF), vitamina A, factor de crecimiento transformante β (TGF-β) y otras citocinas. Curiosamente, el suero es rico en TGF-β y vitamina A, que se cree que desempeñan un papel fundamental en la proliferación epidérmica 2,3,4,5. Además, al tratar a pacientes con enfermedades de la superficie ocular, varios estudios han demostrado algunas ventajas de las gotas oftálmicas AS en los resultados informados por los pacientes, otros parámetros objetivos del ojo seco 6,7 y hallazgos microscópicos como la densidad celular8. Los estudios de metanálisis revelaron que podría haber algunos beneficios en la mejora de los síndromes del paciente con el tratamiento con gotas oftálmicas para la EA, pero aún faltan resultados y observaciones a largo plazo 9,10.
A diferencia de la EA, el plasma rico en plaquetas (PRP) se deriva de la adición de un anticoagulante durante la preparación, con una centrifugación diferencial adicional y la activación química de las plaquetas. En comparación con la EA, numerosos productos químicos y factores de crecimiento, como TGF-β, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y EGF, están presentes en PRP. También se ha aplicado a las enfermedades de la superficie ocular con beneficios clínicos en el alivio de los síntomas11.
El vínculo cruzado entre los defectos epiteliales y la inflamación es complejo. En particular, la inmunofisiopatología es otro tema importante en las enfermedades de la superficie ocular. Se cree que las citoquinas proinflamatorias, como IL-1β e IFN-γ, son mediadores fundamentales en cascadas inflamatorias12. Se abren así nuevas vías de tratamiento basadas en la comprensión del mecanismo inmune. Las estrategias para detener este proceso inflamatorio, incluyendo la producción de antagonistas del receptor de interleucina-1 (IL-1Ra) y otras citoquinas antiinflamatorias, también pueden desempeñar un papel importante en las enfermedades de la superficie ocular13,14,15.
Desde 1998, Orthokine, un suero condicionado autólogo (SCA) comercializado, ha sido utilizado clínicamente en pacientes ortopédicos que sufren de osteoartritis (OA), artritis reumatoide (AR) y trastornos de la columna vertebral13. En comparación con AS y PRP, el tratamiento con perlas de vidrio recubiertas químicamente y la incubación hipóxica para activar monocitos son las características específicas de ACS16. Teóricamente, se pueden secretar más factores antiinflamatorios al agregar estrés de supervivencia a las células, lo que resulta en una mayor concentración de componentes inmunomoduladores esenciales, incluida la IL-1Ra. Los beneficios terapéuticos mejorados del SCA en la OA, en comparación con la EA, también han sido reportados17. Las enfermedades de la superficie ocular comparten antecedentes inmunes similares con las enfermedades inflamatorias ortopédicas en algunos aspectos. Por lo tanto, sobre la base de los resultados exitosos de la terapia derivada de la sangre humana en el campo ortopédico, el SCA podría tener ventajas sobre los tratamientos convencionales en la práctica clínica por sus propiedades epiteliotrópicas e inmunomoduladoras. Aunque el SCA ha sido ampliamente utilizado en enfermedades inflamatorias ortopédicas, sus aplicaciones clínicas en oftalmología aún necesitan ser exploradas, lo que puede verse obstaculizado por su alto costo, falta de apoyo de la literatura y falta de estandarización del proceso de preparación, lo que resulta en un rendimiento diverso.
En este artículo de video, se demostró un método novedoso, rentable y conveniente para generar el ACS modificado (mACS), o plasma rico en factores de crecimiento (PRGF), produciendo una solución de gotas para los ojos con un valor práctico comparable al ACS comercializado. Se mantuvieron las ideas clave de agregar anticoagulantes y activar las células sanguíneas para secretar citoquinas antiinflamatorias mediante incubación estresada, pero a diferencia de los métodos inducidos químicamente, como los basados en perlas de vidrio recubiertas de CrSO4 y kits comerciales, el estado de estrés crítico es inducido físicamente por la incubación hipóxica en este método. Además, se agregó glicerol para proporcionar beneficios adicionales, incluido un aumento en la estabilidad de la membrana de las células sanguíneas, el mantenimiento de una presión adecuada del líquido extracelular osmótico18 y una fuente adecuada de nutrientes en condiciones hipóxicas que evitan el estrés excesivo de las células.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, se describe un protocolo para la preparación de mACS y se muestra además el beneficio de las gotas oftálmicas mACS en la cicatrización de heridas de modelos animales. La modificación crucial de este protocolo mACS es la adición de aproximadamente 0,5 ml de solución de glicerol al 10% en cada tubo de ensayo, lo que crea condiciones hipóxicas adecuadas durante la incubación de 4 h a 37 °C. Esta configuración proporciona al AS el estrés adecuado y hace que las células secreten los factores de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Ya-Lan Chien y Chia-Ying Lee por su excelente asistencia técnica, y a la empresa OnLine English por la edición lingüística. Este estudio fue financiado en parte por el Proyecto de Investigación Médica Chang Gung (Subvención No. CMRPG3L1491).
Materials
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
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