عزل وتحليل النسخ لأنواع الخلايا النباتية
Summary
تبشر جدوى وفعالية طرق scRNA-seq عالية الإنتاجية بعصر الخلية الواحدة في أبحاث النبات. يظهر هنا إجراء قوي وكامل لعزل أنواع معينة من خلايا جذر Arabidopsis thaliana وبناء مكتبة النسخ اللاحقة وتحليلها.
Abstract
في الكائنات الحية متعددة الخلايا، يمكن أن تكون البرمجة التنموية والاستجابات البيئية متباينة للغاية في أنواع الخلايا المختلفة أو حتى داخل الخلايا، وهو ما يعرف بعدم التجانس الخلوي. في السنوات الأخيرة ، أصبح عزل الخلية الواحدة ونوع الخلية جنبا إلى جنب مع تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) أدوات مهمة لدراسة العمليات البيولوجية بدقة خلية واحدة. ومع ذلك، فإن عزل الخلايا النباتية أكثر صعوبة نسبيا بسبب وجود جدران الخلايا النباتية، وهو ما يحد من تطبيق نهج الخلية الواحدة في النباتات. يصف هذا البروتوكول إجراء قويا لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) القائم على عزل الخلية الواحدة ونوع الخلية مع الخلايا النباتية ، وهو مناسب للتحليل متعدد الأوميكس المصب والدراسات الأخرى. باستخدام خطوط علامات الفلورسنت الجذرية Arabidopsis ، نوضح كيف يتم عزل أنواع معينة من الخلايا ، مثل خلايا pericycle ذات قطب الخشب ، والخلايا الأولية للجذر الجانبي ، وخلايا غطاء الجذر الجانبي ، وخلايا القشرة ، وخلايا الأديم الباطن. علاوة على ذلك ، يتم أيضا توفير طريقة فعالة لتحليل النسخ النهائي باستخدام Smart-seq2. يمكن تكييف طريقة عزل الخلايا وتقنيات تحليل النسخ مع أنواع الخلايا والأنواع النباتية الأخرى ولها إمكانات تطبيق واسعة في علوم النبات.
Introduction
الخلايا هي الوحدة الأساسية لجميع الكائنات الحية وتؤدي وظائف هيكلية وفسيولوجية. على الرغم من أن الخلايا في الكائنات متعددة الخلايا تظهر تزامنا واضحا ، إلا أن الخلايا من أنواع مختلفة وخلايا فردية تظهر اختلافات في نسخها أثناء التطور والاستجابات البيئية. يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية عالي الإنتاجية (scRNA-seq) قوة غير مسبوقة لفهم عدم التجانس الخلوي. ساهم تطبيق scRNA-seq في علوم النبات في بناء أطلس الخلايا النباتية1 بنجاح ، وقد تم استخدامه لتحديد الأصناف الخلوية النادرة في الأنسجة النباتية2 ، وقدم نظرة ثاقبة لتكوين أنواع الخلايا في الأنسجة النباتية ، وتم استخدامه لتحديد الهوية الخلوية والوظائف المهمة المستخدمة أثناء تطوير النبات وتمايزه. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن استنتاج مسارات النمو الزماني المكاني في الأنسجة النباتية1،2،3 لاكتشاف جينات علامة جديدة4 ودراسة وظائف عوامل النسخ المهمة5 باستخدام scRNA-seq من أجل الكشف عن الحفظ التطوري لنفس نوع الخلية في النباتات المختلفة 3. تعد الضغوط اللاأحيائية من بين أهم التأثيرات البيئية على نمو النبات وتطوره. من خلال استكشاف التغييرات في تكوين أنواع الخلايا في الأنسجة النباتية في ظل ظروف معالجة مختلفة من خلال تسلسل النسخ أحادي الخلية ، يمكن للمرء أيضا حل آلية الاستجابة للإجهاد اللاأحيائي6.
تعتمد إمكانية حل عدم تجانس النسخ بين أنواع الخلايا باستخدام تسلسل scRNA على طريقة عزل الخلية ومنصة التسلسل. فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع لعزل مجموعة فرعية من الخلايا من أجل scRNA-seq بناء على تشتت الضوء وخصائص مضان الخلايا. وقد أدى تطوير خطوط علامات الفلورسنت بواسطة التكنولوجيا المحورة وراثيا إلى تحسن كبير في كفاءة عزل الخلايا بواسطة نظام مراقبة الأصولالميدانية 7. إن إجراء scRNA-seq باستخدام Smart-seq28 يعزز القدرة على تشريح عدم التجانس الخلوي. تتمتع طريقة Smart-seq2 بحساسية جيدة للكشف عن الجينات ويمكنها اكتشاف الجينات حتى مع إدخال نسخة منخفضة9. بالإضافة إلى جمع نوع الخلية السائبة ، توفر أجهزة فرز الخلايا الحديثة تنسيق فرز فهرس أحادي الخلية ، مما يسمح بتحليل النسخ بدقة خلية واحدة باستخدام Smart-seq210 أو طرق RNA-seq متعددة الإرسال الأخرى ، مثل CEL-seq211. يمكن استخدام الفرز أحادي الخلية أو نوع الخلية للعديد من التطبيقات النهائية الأخرى ، مثل الدراسات المتوازية متعددة الأوميكس12،13. يظهر هنا بروتوكول قوي ومتعدد الاستخدامات لعزل أنواع الخلايا النباتية، مثل خلايا البريسيكل ذات القطب الزاكيل، وخلايا غطاء الجذر الجانبي، والخلايا الأولية للجذر الجانبي، وخلايا القشرة، وخلايا الأديم الباطن من جذور خطوط خلايا علامة أرابيدوبسيس ثاليانا بواسطة FACS. يتضمن البروتوكول أيضا إنشاء مكتبة Smart-seq2 لتحليل النسخ النهائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن للبروتوكول المستند إلى Smart-seq2 إنشاء مكتبات تسلسل موثوقة من عدة مئات من الخلايا8. جودة المواد الأولية ضرورية لدقة تحليل النسخ. FACS هو أداة قوية لإعداد الخلايا ذات الأهمية ، ولكن يجب تحسين هذا الإجراء ، وخاصة خطوة protoplasting ، لتطبيقات النبات. يمكن أيضا استخدام التشريح المجهري ل…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أنشأنا هذا البروتوكول في منشأة متعددة الخلايا أحادية الخلية تابعة لكلية الزراعة والبيولوجيا ، جامعة شنغهاي جياو تونغ ، وتم دعمنا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 32070608) ، وبرنامج شنغهاي بوجيانغ (المنحة رقم 20PJ1405800) ، وجامعة شنغهاي جياو تونغ (رقم المنحة Agri-X20200202 ، 2019TPB05).
Materials
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
- Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
- Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
- Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
- Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
- Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
- Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
- Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
- Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
- De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
- Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
- Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in next-generation sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).
- Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
- Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
- Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
- Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
- Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Long, J., et al. Nurse cell–derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
- Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).
