Isolering og transkriptomanalyse af plantecelletyper
Summary
Gennemførligheden og effektiviteten af scRNA-seq-metoder med høj kapacitet indvarsler en enkeltcelleæra inden for planteforskning. Her præsenteres en robust og komplet procedure til isolering af specifikke Arabidopsis thaliana rodcelletyper og efterfølgende transkriptombibliotekskonstruktion og analyse.
Abstract
I flercellede organismer kan udviklingsprogrammering og miljøresponser være meget divergerende i forskellige celletyper eller endda inden for celler, hvilket er kendt som cellulær heterogenitet. I de senere år er enkeltcelle- og celletypeisolering kombineret med næste generations sekventeringsteknikker (NGS) blevet vigtige værktøjer til at studere biologiske processer ved enkeltcelleopløsning. Imidlertid er isolering af planteceller relativt vanskeligere på grund af tilstedeværelsen af plantecellevægge, hvilket begrænser anvendelsen af enkeltcellemetoder i planter. Denne protokol beskriver en robust procedure til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)-baseret enkeltcelle- og celletypeisolering med planteceller, som er velegnet til downstream multi-omics-analyse og andre undersøgelser. Ved hjælp af Arabidopsis rodfluorescerende markørlinjer demonstrerer vi, hvordan bestemte celletyper, såsom xylempol-pericykelceller, laterale rodudgangsceller, laterale rodhætteceller, cortexceller og endodermale celler, isoleres. Desuden leveres også en effektiv nedstrøms transkriptomanalysemetode ved hjælp af Smart-seq2. Celleisoleringsmetoden og transkriptomanalyseteknikkerne kan tilpasses andre celletyper og plantearter og har et bredt anvendelsespotentiale inden for plantevidenskab.
Introduction
Celler er den grundlæggende enhed for alle levende organismer og udfører strukturelle og fysiologiske funktioner. Selvom cellerne i flercellede organismer viser tilsyneladende synkronicitet, præsenterer celler af forskellige typer og individuelle celler forskelle i deres transkriptomer under udvikling og miljøresponser. High-throughput single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) giver hidtil uset kraft til forståelse af cellulær heterogenitet. Anvendelse af scRNA-seq i plantevidenskab har bidraget til vellykket konstruktion af et plantecelleatlas1, er blevet brugt til at identificere sjældne cellulære taxa i plantevæv2, har givet indsigt i sammensætningen af celletyper i plantevæv og er blevet brugt til at identificere cellulær identitet og vigtige funktioner, der anvendes under planteudvikling og differentiering. Derudover er det muligt at udlede spatiotemporale udviklingsbaner i plantevæv 1,2,3 for at opdage nye markørgener4 og studere funktionerne af vigtige transkriptionsfaktorer 5 ved hjælp af scRNA-seq for at afsløre den evolutionære bevarelse af den samme celletype i forskellige planter 3. Abiotiske belastninger er blandt de vigtigste miljøpåvirkninger på plantevækst og udvikling. Ved at undersøge ændringerne i sammensætningen af celletyper i plantevæv under forskellige behandlingsbetingelser gennem enkeltcelletranskriptomsekventering kan man også løse den abiotiske stressresponsmekanisme6.
Potentialet for at løse transkriptionel heterogenitet mellem celletyper ved hjælp af scRNA-sekventering afhænger af celleisolationsmetoden og sekventeringsplatformen. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) er en meget anvendt teknik til isolering af en delpopulation af celler til scRNA-seq baseret på lysspredning og cellernes fluorescensegenskaber. Udviklingen af fluorescerende markørlinjer ved hjælp af transgen teknologi har i høj grad forbedret effektiviteten af celleisolering med FACS7. Udførelse af scRNA-seq ved hjælp af Smart-seq28 forbedrer yderligere evnen til at dissekere den cellulære heterogenitet. Smart-seq2-metoden har god følsomhed for gendetektion og kan detektere gener selv med et lavt transkriptionsinput9. Ud over indsamling af bulkcelletyper giver moderne cellesorterere et enkeltcelleindekssorteringsformat, der tillader transkriptomanalyse ved enkeltcelleopløsning ved hjælp af Smart-seq210 eller andre multipleksede RNA-seq-metoder, såsom CEL-seq211. Enkeltcelle- eller cellesortering kan potentielt bruges til mange andre downstream-applikationer, såsom parallelle multi-omics-undersøgelser12,13. Præsenteret her er en robust og alsidig protokol til isolering af plantecelletyper, såsom xylempol pericykelceller, laterale rodhætteceller, laterale rodudgangsceller, cortexceller og endodermale celler fra rødderne af Arabidopsis thaliana markørcellelinjer af FACS. Protokollen involverer yderligere konstruktion af Smart-seq2-biblioteket til downstream-transkriptomanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den Smart-seq2-baserede protokol kan generere pålidelige sekventeringsbiblioteker fra flere hundrede celler8. Udgangsmaterialets kvalitet er afgørende for nøjagtigheden af transkriptomanalysen. FACS er et kraftfuldt værktøj til fremstilling af celler af interesse, men denne procedure, især protoplasteringstrinnet, skal optimeres til planteapplikationer. Laserfangstmikrodissektion (LCM) eller manuelle dissekerede celler kan også bruges som input25,26, så protokollen,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi oprettede denne protokol i enkeltcelle multi-omics-anlægget på School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University og blev støttet af National Natural Science Foundation of China (bevilling nr. 32070608), Shanghai Pujiang-programmet (tilskud nr. 20PJ1405800) og Shanghai Jiao Tong University (bevilling nr. Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
- Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
- Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
- Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
- Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
- Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
- Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
- Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
- Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
- De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
- Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
- Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in next-generation sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).
- Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
- Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
- Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
- Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
- Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Long, J., et al. Nurse cell–derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
- Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).
