Isolering och transkriptomanalys av växtcelltyper
Summary
Genomförbarheten och effektiviteten av scRNA-seq-metoder med hög genomströmning förebådar en encellsera i växtforskning. Här presenteras en robust och komplett procedur för att isolera specifika Arabidopsis thaliana rotcellstyper och efterföljande transkriptombibliotekskonstruktion och analys.
Abstract
I flercelliga organismer kan utvecklingsprogrammering och miljösvar vara mycket divergerande i olika celltyper eller till och med inom celler, vilket är känt som cellulär heterogenitet. Under de senaste åren har isolering av encells- och celltyp i kombination med nästa generations sekvenseringstekniker (NGS) blivit viktiga verktyg för att studera biologiska processer med encellsupplösning. Att isolera växtceller är emellertid relativt svårare på grund av närvaron av växtcellväggar, vilket begränsar tillämpningen av encelliga metoder i växter. Detta protokoll beskriver en robust procedur för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)-baserad encells- och celltypisolering med växtceller, vilket är lämpligt för nedströms multi-omics-analys och andra studier. Med hjälp av Arabidopsis rotfluorescerande markörlinjer demonstrerar vi hur specifika celltyper, såsom xylem-pole pericycle-celler, laterala rotinitialceller, laterala rotlockceller, cortexceller och endodermala celler, isoleras. Dessutom tillhandahålls en effektiv nedströms transkriptomanalysmetod med Smart-seq2. Cellisoleringsmetoden och transkriptomanalysteknikerna kan anpassas till andra celltyper och växtarter och har bred tillämpningspotential inom växtvetenskap.
Introduction
Celler är den grundläggande enheten för alla levande organismer och utför strukturella och fysiologiska funktioner. Även om cellerna i flercelliga organismer visar uppenbar synkronicitet, uppvisar celler av olika typer och enskilda celler skillnader i deras transkriptom under utveckling och miljösvar. High-throughput single-cell RNA-sekvensering (scRNA-seq) ger oöverträffad kraft för att förstå cellulär heterogenitet. Tillämpning av scRNA-seq inom växtvetenskap har bidragit till att framgångsrikt konstruera en växtcellatlas1, har använts för att identifiera sällsynta cellulära taxa i växtvävnader2, har gett insikt i sammansättningen av celltyper i växtvävnader och har använts för att identifiera cellulär identitet och viktiga funktioner som används under växtutveckling och differentiering. Dessutom är det möjligt att härleda spatiotemporala utvecklingsbanor i växtvävnader 1,2,3 för att upptäcka nya markörgener4 och studera funktionerna hos viktiga transkriptionsfaktorer 5 med hjälp av scRNA-seq för att avslöja det evolutionära bevarandet av samma celltyp i olika växter 3. Abiotiska påfrestningar är bland de viktigaste miljöpåverkan på växttillväxt och utveckling. Genom att utforska förändringarna i sammansättningen av celltyper i växtvävnader under olika behandlingsförhållanden genom encellstranskriptomsekvensering kan man också lösa den abiotiska stressresponsmekanismen6.
Potentialen för att lösa transkriptionell heterogenitet mellan celltyper med scRNA-sekvensering beror på cellisoleringsmetoden och sekvenseringsplattformen. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) är en allmänt använd teknik för att isolera en subpopulation av celler för scRNA-seq baserat på ljusspridning och cellernas fluorescensegenskaper. Utvecklingen av fluorescerande markörlinjer med transgen teknik har avsevärt förbättrat effektiviteten av cellisolering med FACS7. Att genomföra scRNA-seq med Smart-seq28 förbättrar ytterligare förmågan att dissekera den cellulära heterogeniteten. Smart-seq2-metoden har god känslighet för gendetektion och kan detektera gener även med låg transkriptingång9. Förutom insamling av bulkcelltyp tillhandahåller moderna cellsorterare ett sorteringsformat för encellsindex, vilket möjliggör transkriptomanalys vid encellsupplösning med Smart-seq210 eller andra multiplexerade RNA-seq-metoder, såsom CEL-seq211. Sortering av encells- eller celltyp kan potentiellt användas för många andra nedströmsapplikationer, såsom parallella multi-omics-studier12,13. Här presenteras ett robust och mångsidigt protokoll för att isolera växtcelltyper, såsom xylem-pole pericykelceller, laterala rotlockceller, laterala rotinitialceller, cortexceller och endodermala celler från rötterna till Arabidopsis thaliana markörcellinjer av FACS. Protokollet innefattar vidare att konstruera Smart-seq2-biblioteket för transkriptomanalys nedströms.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det Smart-seq2-baserade protokollet kan generera tillförlitliga sekvenseringsbibliotek från flera hundra celler8. Utgångsmaterialets kvalitet är avgörande för transkriptomanalysens noggrannhet. FACS är ett kraftfullt verktyg för att förbereda celler av intresse, men denna procedur, särskilt protoplastionssteget, måste optimeras för växtapplikationer. Laserinfångningsmikrodissektion (LCM) eller manuella dissekerade celler kan också användas som ingång25,26<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi satte upp detta protokoll i encellsanläggningen för multi-omics vid School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, och stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) och Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
- Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
- Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
- Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
- Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
- Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
- Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
- Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
- Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
- De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
- Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
- Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in next-generation sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).
- Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
- Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
- Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
- Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
- Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Long, J., et al. Nurse cell–derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
- Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).
