Le présent protocole décrit les étapes de purification et les études ultérieures de quatre β-glucanes fongiques différents en tant que molécules immunomodulatrices potentielles qui améliorent les propriétés antitumorales de la microglie contre les cellules de glioblastome.
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Article de méthode
Isolement et purification du β-glucane fongique comme stratégie d’immunothérapie pour le glioblastome
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’un des plus grands défis dans le développement de thérapies efficaces contre le glioblastome est de surmonter la forte suppression immunitaire dans le microenvironnement tumoral. L’immunothérapie est apparue comme une stratégie efficace pour retourner la réponse du système immunitaire contre les cellules tumorales. Les macrophages et microglies associés aux gliomes (GAM) sont les principaux moteurs de tels scénarios anti-inflammatoires. Par conséquent, l’amélioration de la réponse anticancéreuse dans les GAM peut représenter un traitement coadjuvant potentiel pour traiter les patients atteints de glioblastome. Dans cette veine, les molécules fongiques β-glucane sont connues depuis longtemps comme de puissants modulateurs immunitaires. Leur capacité à stimuler l’activité immunitaire innée et à améliorer la réponse au traitement a été décrite. Ces caractéristiques modulatrices sont en partie attribuées à leur capacité à se lier aux récepteurs de reconnaissance de formes, qui, fait intéressant, sont grandement exprimés dans les GAM. Ainsi, ce travail est axé sur l’isolement, la purification et l’utilisation ultérieure de β-glucanes fongiques pour améliorer la réponse tumoricide de la microglie contre les cellules de glioblastome. Les lignées cellulaires de glioblastome de souris (GL261) et de microglie (BV-2) sont utilisées pour tester les propriétés immunomodulatrices de quatre β-glucanes fongiques différents extraits de champignons fortement utilisés dans l’industrie biopharmaceutique actuelle: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus et Ganoderma lucidum. Pour tester ces composés, des tests de co-stimulation ont été effectués pour mesurer l’effet d’un milieu conditionné par la microglie pré-activé sur la prolifération et l’activation de l’apoptose dans les cellules de glioblastome.
Introduction
Malgré l’avènement de nouvelles réalisations dans le domaine de la neuro-oncologie, l’espérance de vie des patients atteints de glioblastome reste maigre. Les thérapies de référence contre les tumeurs cérébrales sont basées sur la fusion de la chirurgie, de la radiothérapie et de la chimiothérapie. Cependant, au cours de la dernière décennie, l’immunothérapie est apparue comme une stratégie puissante pour traiter différents types de cancer1. Ainsi, la possibilité d’exploiter la réponse immunitaire de l’organisme contre les cellules tumorales est récemment devenue le quatrième pilier de l’oncologie.
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Protocole
Les quatre variantes différentes de champignons décrites dans ce protocole ont été obtenues à partir d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).
1. Isolement des β-glucanes fongiques
- Extraction et isolement des polysaccharides solubles des champignons
NOTE: Les polysaccharides solubles de champignons (SMP) ont été obtenus selon la procédure schématiquement illustrée à la figure 1.- Rincer doucement les fructifications fraîches de P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus et G. lucidum (environ 2 000 g/champignon) ....
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Résultats
Purification réussie des β-glucanes
La masse de MP, SMP et SβG obtenue à partir des fructifications de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus après le processus d’extraction et de purification est résumée dans le tableau 1. La composition de base (glucides totaux, β-glucanes et protéines) des MP, SMP et SβG obtenus à partir des champignons est représentée dans le tableau 2. Ces résultats montrent comment le protocole a .......
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Discussion
Ce travail décrit l’utilisation de techniques bien établies pour isoler, purifier et caractériser avec succès la teneur en SβG de quatre champignons différents. Les résultats ont montré comment, après l’extraction à l’eau chaude des SMP, obtenue à partir de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus, suivie d’un traitement hydrolytique à la α-amylase, à la glucosidase et à la protéase, la teneur en α-glucane et en protéines a été réduite, enrichissant ainsi de manière significative la .......
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Déclarations de divulgation
Il n’y a pas d’intérêts concurrents à déclarer.
Remerciements
Nous tenons à remercier le Dr Vasiliki Economopoulos pour son script interne permettant de mesurer le signal de fuluorescence dans ImageJ. Nous tenons également à remercier le CITIUS (Université de Séville) et tout leur personnel pour leur soutien lors de la manifestation. Ce travail a été soutenu par le FEDER espagnol I + D + i-USE, US-1264152 de l’Université de Séville, et le Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Lames de chambre à 8 puits | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Four de séchage à l’air | J.P. Selecta S.A., Espagne | 2000210 | |
| Albumine | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Danemark | protéase | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Broyeur à lames | Retsch, Allemagne | ; SM100 | |
| Albumine sérique bovine | MERK, Allemagne | A9418 | |
| Membrane de tube en cellulose | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifugeuse | MERK, Allemagne | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ;) | |
| DAPI | MERK, Allemagne | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Danemark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´ ; s modifié Eagle´ ; s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, États-Unis | 10564011 | |
| Extenda (&alpha ;- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Sérum fœtal bovin | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, États-Unis | A4736301 | |
| Spectromete FT-IR | Bruker-Vertex, Suisse | VERTEX 70v | |
| Logiciel | de représentation graphique et d’analyseGraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| Système HPLC | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 Incubateur HPLC | |
| Eppedorf | Galaxy 170S | ||
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldéhyde | MERK, Allemagne | P6148 | |
| Pénicilline/streptomycine | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| Ph-mètre | Crison, Barcelone, Espagne | Basic 20 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Anticorps Caspase-3 clivé de lapin (Asp175) | Abcam, Royaume-Uni | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Thermofisher monoclonal | , USA | MA5-14520 | |
| Évaporateur rotatif | Bü ; chi Ibé ; rica S.L.U., Espagne | El Rotavapor R-100 | |
| Colonne de filtration linéaire sur gel ultra-hydrogel (300 mm x 7,8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, États-Unis | WAT011545 | |
| Spectrophotomètre UV-Visible | Amersham Bioscience, Royaume-Uni | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, ÉTATS-UNIS | H-5000-60 | |
| Bain d’eau | J.P. Selecta S.A., Espagne | ||
| Système de microscope confocal Zeiss LSM 7 DUO. | Zeiss, Allemagne | ||
| &beta ;-glucanes Kit d’essai | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Irlande | K-BGLU | |
| &beta ;-glucanes | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Fourni les quatre variantes de champignons |
Références
- Aldape, K., et al. Challenges to curing primary brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).
- Himes, B. T., et al. Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications. Fr....
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Réimpressions et autorisations
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