Musemodeller kan være nyttige verktøy for å undersøke biologien til retinalpigmentert epitel (RPE). Det har blitt fastslått at mus kan utvikle en rekke RPE-patologier. Her beskriver vi en fenotypingsprotokoll for å belyse og kvantifisere RPE-patologier hos mus ved hjelp av lys, transmisjonselektron og konfokalmikroskopi.
Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) er en svekkende retinal lidelse i aldrende befolkninger. Det er allment antatt at dysfunksjon av retinalpigmentert epitel (RPE) er en viktig patobiologisk hendelse i AMD. For å forstå mekanismene som fører til RPE-dysfunksjon, kan musemodeller brukes av forskere. Det har blitt fastslått av tidligere studier at mus kan utvikle RPE-patologier, hvorav noen observeres i øynene til personer diagnostisert med AMD. Her beskriver vi en fenotypingsprotokoll for å vurdere RPE-patologier hos mus. Denne protokollen inkluderer fremstilling og evaluering av retinale tverrsnitt ved bruk av lysmikroskopi og transmisjonselektronmikroskopi, samt RPE-flatfester ved konfokalmikroskopi. Vi beskriver de vanlige typene murine RPE-patologier observert av disse teknikkene og måter å kvantifisere dem gjennom objektive metoder for statistisk testing. Som bevis på konsept bruker vi denne RPE-fenotypingsprotokollen for å kvantifisere RPE-patologiene observert hos mus som overuttrykker transmembranprotein 135 (Tmem135) og eldre C57BL/6J-mus av villtype C57BL/6J. Hovedmålet med denne protokollen er å presentere standard RPE-fenotypingsmetoder med objektive kvantitative vurderinger for forskere som bruker musemodeller av AMD.
Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) er en vanlig blindende sykdom som rammer populasjoner over 55 år1. Mange forskere mener at dysfunksjon i retinalpigmentert epitel (RPE) er en tidlig og avgjørende patobiologisk hendelse i AMD2. RPE er et monolag av polariserte celler som har til oppgave å opprettholde homeostasen til nærliggende fotoreceptorer og koroidale blodkar3. Det finnes en rekke modeller for å undersøke sykdomsassosierte mekanismer i RPE, inkludert cellekulturmodeller 4,5 og mus 6,7,8. En fersk rapport har beskrevet standardiserte protokoller og kvalitetskontrollkriterier for RPE-cellekulturmodeller4, men ingen rapport har forsøkt å standardisere fenotypingen av RPE i musemodeller. Faktisk mangler mange publikasjoner på musemodeller av AMD en fullstendig beskrivelse av RPE eller kvantifisering av RPE-patologiene i dem. Det overordnede målet med denne protokollen er å presentere standard RPE-fenotypingsmetoder med objektive kvantitative vurderinger for forskere som bruker AMD-musemodeller.
Tidligere publikasjoner har notert tilstedeværelsen av flere RPE-patologier hos mus gjennom tre bildebehandlingsteknikker. For eksempel tillater lysmikroskopi forskere å se brutto morfologi av murine retina (figur 1A) og oppdage RPE-patologier som RPE-tynning, vakuolisering og migrasjon. RPE-tynning i en AMD-musemodell eksemplifiseres av et avvik i RPE-høyden fra deres respektive kontroller (figur 1B). RPE-vakuolisering kan deles inn i to separate kategorier: mikrovakuolisering (figur 1C) og makrovakuolisering (figur 1D). RPE-mikrovakuolisering er oppsummert ved tilstedeværelsen av vakuoler i RPE som ikke påvirker dens totale høyde, mens makrovakuolisering indikeres av tilstedeværelsen av vakuoler som stikker ut i de ytre segmentene av fotoreceptorene. RPE-migrasjon kjennetegnes ved fokalaggregatet av pigment over RPE-monolaget i et retinalt tverrsnitt (figur 1E). Det skal bemerkes at migrerende RPE-celler i AMD-donorøyne utviser immunoreaktivitet mot immuncellemarkører, for eksempel klynge av differensiering 68 (CD68) 9, og kan representere immunceller som oppsluker RPE-rusk eller RPE som gjennomgår transdifferensiering 9. En annen bildebehandlingsteknikk kalt transmisjonselektronmikroskopi kan tillate forskere å visualisere ultrastrukturen til RPE og dens kjellermembran (figur 2A). Denne teknikken kan identifisere den dominerende sub-RPE-forekomsten hos mus, kjent som basal laminær forekomst (BLamD) (figur 2B)10. Til slutt kan konfokalmikroskopi avsløre strukturen til RPE-celler gjennom avbildning av RPE-flatfester (figur 3A). Denne metoden kan avdekke RPE-dysmorfi, avviket fra RPE fra sin klassiske bikakeform (figur 3B). Det kan også oppdage RPE multinukleasjon, tilstedeværelsen av tre eller flere kjerner i en RPE-celle (figur 3C). For et sammendrag av hvilke typer RPE-patologier som er tilstede i dagens AMD-musemodeller, henviser vi forskere til disse vurderingene fra litteraturen 6,7.
Forskere som studerer AMD bør være oppmerksomme på fordelene og ulempene ved å bruke mus til å undersøke RPE-patologier før fenotypingsprotokollen. Mus er fordelaktige på grunn av deres relativt korte levetid og kostnadseffektivitet, samt deres genetiske og farmakologiske manipulerbarhet. Mus viser også RPE-degenerative endringer, inkludert RPE-migrasjon, dysmorfi og multinukleering, som observeres i AMD-donorøyne 11,12,13,14,15,16,17; Dette antyder at lignende mekanismer kan ligge til grunn for utviklingen av disse RPE-patologiene hos mus og mennesker. Imidlertid er det viktige forskjeller som begrenser oversettbarheten av musestudier til human AMD. For det første har mus ikke en makula, en anatomisk distinkt region av den menneskelige netthinnen som er nødvendig for synsstyrke som fortrinnsvis påvirkes i AMD. For det andre er noen RPE-patologier hos mus, som RPE-tynning og vakuolisering, vanligvis ikke sett i AMD-donorøyne18. For det tredje utvikler mus ikke drusen, et kjennetegn ved AMD-patologi19. Drusen er lipid- og proteinholdige avleiringer med svært få kjellermembranproteiner som dannes mellom RPE basal lamina og det indre kollagenøse laget av Bruchs membran (BrM)19. Drusen skiller seg fra BLamD, den vanlige sub-RPE-forekomsten hos mus, både i sammensetning og anatomisk plassering. BLamDs er alders- og stressavhengige ekstracellulære matriksberikede abnormiteter som dannes mellom RPE basal lamina av BrM og de basale infoldingene av RPE20. Interessant nok har BLamDs en lignende proteinsammensetning og utseende hos både mus og mennesker 6,10,21. Nylig arbeid tyder på at BLamDs kan virke i patobiologien til AMD ved å påvirke utviklingen av AMD til sine senere stadier18,22; Dermed kan disse forekomstene representere syk RPE i musehinnen. Kunnskap om disse fordelene og begrensningene er avgjørende for forskere som er interessert i å oversette resultater fra musestudier til AMD.
I denne protokollen diskuterer vi metodene for å forberede øynene på lys, transmisjonselektron og konfokalmikroskopi for å visualisere RPE-patologier. Vi beskriver også hvordan man kvantifiserer RPE-patologier på en objektiv måte for statistisk testing. Som bevis på konsept bruker vi RPE-fenotypingsprotokollen for å undersøke de strukturelle RPE-patologiene observert i transmembranprotein 135- (Tmem135) som overuttrykker mus og alderen villtype (WT) C57BL/6J-mus. Oppsummert tar vi sikte på å beskrive fenotypingsmetodikken for å karakterisere RPE i AMD-musemodeller, siden det for øyeblikket ikke er noen standardprotokoller tilgjengelig. Forskere som er interessert i å undersøke og kvantifisere patologier av fotoreceptorene eller choroid, som også påvirkes i AMD-musemodeller, kan ikke finne denne protokollen nyttig for sine studier.
I denne artikkelen introduserte vi en fenotypingsprotokoll for å vurdere de strukturelle RPE-patologiene til musemodeller. Vi beskrev trinnene som kreves for å behandle øynene for ulike bildebehandlingsteknikker, inkludert lys, transmisjonselektron og konfokal mikroskopi, samt kvantifisering av typiske patologier observert via disse bildebehandlingsmetodene. Vi beviste effektiviteten av vår RPE-fenotypingsprotokoll ved å undersøke Tmem135 TG og 24 måneder gamle WT-mus, siden disse musene viser RP…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne anerkjenne Satoshi Kinoshita og University of Wisconsin (UW) Translational Research Initiatives in Pathology laboratory (TRIP) for å forberede vevene våre for lysmikroskopi. Denne kjernen støttes av UW Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin Carbone Cancer Center (P30 CA014520), og Office of The Director-NIH (S10OD023526). Konfokalmikroskopi ble utført ved UW Biochemistry Optical Core, som ble etablert med støtte fra UW Department of Biochemistry Endowment. Dette arbeidet ble også støttet av tilskudd fra National Eye Institute (R01EY022086 til A. Ikeda; R01EY031748 til C. Bowes Rickman; P30EY016665 til Institutt for oftalmologi og visuelle ved UW; P30EY005722 til Duke Eye Center; NIH T32EY027721 til M. Landowski; F32EY032766 til M. Landowski), Timothy William Trout formannskap (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); og et ubegrenset tilskudd fra Research to Prevent Blindness (Duke Eye Center).
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 | PolyScientiifc R&D Company | S1619 | |
100 Capacity Slide Box | Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.) | ||
100% Ethanol | MDS Warehouse | 2292-CASE | Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol. |
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks | Qosina | 11069 | |
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) | Premade 1x PBS can be used in this protocol. | ||
2.0 mL microtubes | Genesee Scientific | 24-283-LR | |
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold | Electron Microscopy Sciences | 70165 | |
24 inch PVC Tubing with Luer Ends | Fisher Scientific | NC1376778 | |
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
95% Ethanol | MDS Warehouse | 2293-CASE | |
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) | VWR | 56616-031 | |
Adjustable 237 ml Spray Bottle | VWR | 23609-182 | |
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
Aluminum Foil | |||
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle | Sigma-Aldrich | Z192546 | |
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-5211 | Known as curved forceps in this protocol. |
Camel Hair Brush | Electron Microscopy Sciences | 65575-02 | |
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber | |||
Carbon Dioxide Flow Meter | |||
Carbon Dioxide Tank | |||
Castaloy Prong Extension Clamps | Fisher Scientific | 05-769-7Q | |
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand | Fisher Scientific | 11-474-207 | |
Cell Prolifer Program | Available to download: https://cellprofiler.org/releases | ||
Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Colorfrost Microscope Slides Lavender | VWR | 10118-956 | |
Computer | |||
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | |
Distilled H20 | Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol. | ||
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 | Roboz Surgical Instrument | RS-4984 | Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing). |
Electron Microscopy Grid Holder | Electron Microscopy Sciences | 71147-01 | |
EPON 815 Resin | Electron Microscopy Sciences | 14910 | |
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye | Fisher Scientific | 22050460 | Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. |
Epredia Mounting Media | Fisher Scientific | 22-110-610 | Use for mounting H&E slides. |
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source | Dolan-Jenner Industries | Mi-150 | Light source for dissecting microscope. |
Fiji ImageJ Program | Available to download: https://imagej.net/downloads | ||
Flexaframe Castaloy Hook Connector | Thermo Scientific | 14-666-18Q | |
Fume hood | |||
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% | Electron Microscopy Sciences | 16537-05 | |
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera | |||
Laboratory Benchtop Shaker | Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room. | ||
Laser Cryo Tag Labels | Electron Microscopy Sciences | 77564-05 | |
Lead Citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
Leica EM UC7Ultramicrotome | |||
Leica Reichert Ultracut S Microtome | |||
LifterSlips | Thermo Fisher Scientific | 22X22I24788001LS | Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE. |
Mayer's Hematoxylin | VWR | 100504-406 | |
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | Known as micro-dissecting scissors in protocol. |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
Mice | Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol. | ||
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | Known as curved scissors in this protocol. |
Microsoft Excel | |||
Microtube racks | |||
Nikon A1RS Confocal Microscope | |||
Normal Donkey Serum | SouthernBiotech | 0030-01 | |
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades | VWR | 21909-380 | |
Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
Paraformaldehyde, 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
Pencil | |||
Petri Dish | VWR | 21909-380 | |
Pipette Tips | |||
Pipettes | |||
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody | Thermo Fisher Scientific | 402200 | |
Propylene Oxide | Electron Microscopy Sciences | 20412 | |
Razor Blade | VWR | 10040-386 | |
Shallow Tray for Mouse Perfusions | |||
Shandon Eosin Y Alcoholic | VWR | 89370-828 | |
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker | Staples | 642736 | |
Slide Rack for Staining | Grainger | 49WF31 | |
Squared Cover Glass Slips | Fisher Scientific | 12-541B | |
Staining Dish with Cover | Grainger | 49WF30 | Need 15 for H&E staining procedure. |
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe | Thermo Scientific | S7510-50 | Use only the syringe barrel. |
Timer | Fisher | 1464917 | |
Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
Vacuum Oven | |||
Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Use for mounting RPE flat mounts. |
Xylene | Fisher Scientific | 22050283 | |
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope | This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. | ||
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope | Electron Microscopy Sciences | 65575-02 |