यह प्रोटोकॉल बताता है कि व्यक्तिगत आयन चैनलों को ट्रैक करने और समर्थित लिपिड झिल्ली में उनकी गतिविधि निर्धारित करने के लिए टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी का उपयोग कैसे करें, जिससे पार्श्व झिल्ली आंदोलन और चैनल फ़ंक्शन के बीच परस्पर क्रिया को परिभाषित किया जा सके। यह वर्णन करता है कि झिल्ली कैसे तैयार करें, डेटा रिकॉर्ड करें और परिणामों का विश्लेषण करें।
उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों से पता चला है कि कई आयन चैनल स्थिर नहीं हैं, लेकिन अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं के अधीन हैं, जिसमें छिद्र बनाने और सहायक सबयूनिट्स, पार्श्व प्रसार और अन्य प्रोटीनों के साथ क्लस्टरिंग का क्षणिक संबंध शामिल है। हालांकि, पार्श्व प्रसार और कार्य के बीच संबंध खराब समझा जाता है। इस समस्या से निपटने के लिए, हम वर्णन करते हैं कि कैसे समर्थित लिपिड झिल्ली में व्यक्तिगत चैनलों की पार्श्व गतिशीलता और गतिविधि की निगरानी की जा सकती है और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सहसंबद्ध किया जा सकता है। बूंद इंटरफ़ेस बाइलेयर (डीआईबी) तकनीक का उपयोग करके अल्ट्राथिन हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर झिल्ली बनाई जाती है। अन्य प्रकार के मॉडल झिल्ली की तुलना में, इन झिल्लियों में यांत्रिक रूप से मजबूत और अत्यधिक संवेदनशील विश्लेषणात्मक तकनीकों के लिए उपयुक्त होने का लाभ है। यह प्रोटोकॉल झिल्ली के करीब निकटता में सीए2 + संवेदनशील डाई के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को देखकर एकल चैनलों के माध्यम से सीए2 + आयन प्रवाह को मापता है। शास्त्रीय एकल-अणु ट्रैकिंग दृष्टिकोण के विपरीत, कोई फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन या लेबल, जो झिल्ली में पार्श्व आंदोलन और कार्य में हस्तक्षेप कर सकता है, की आवश्यकता नहीं होती है। प्रोटीन के संवहन परिवर्तनों से जुड़े आयन प्रवाह में संभावित परिवर्तन केवल झिल्ली में प्रोटीन पार्श्व गति के कारण होते हैं। प्रतिनिधि परिणाम माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन ट्रांसलोकेशन चैनल टीओएम-सीसी और बैक्टीरियल चैनल ओएमपीएफ का उपयोग करके दिखाए जाते हैं। ओएमपीएफ के विपरीत, टीओएम-सीसी की गेटिंग आणविक कारावास और पार्श्व प्रसार की प्रकृति के प्रति बहुत संवेदनशील है। इसलिए, समर्थित ड्रॉपलेट-इंटरफ़ेस बाइलेयर पार्श्व प्रसार और आयन चैनलों के कार्य के बीच की कड़ी को चिह्नित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य यह वर्णन करना है कि बहुलक-समर्थित बूंद-इंटरफ़ेस बाइलेयर (डीआईबी) झिल्ली 1,2,3 में झिल्ली प्रोटीन की झिल्ली गतिशीलता और आयन चैनल पारगम्यता के बीच सहसंबंध का अध्ययन कैसे किया जाए।
वर्तमान तकनीक उन्नत ऑप्टिकल और सतह विश्लेषणात्मक उपकरणों की एक प्रभावशाली सरणी का पूरक है, जैसे कि एकल कण ट्रैकिंग 4,5, प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी 6,7, और उच्च गति परमाणु बल माइक्रोस्कोपी 8,9,10। ये झिल्ली की गतिशील संरचना और संरचना में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं जो झिल्ली-आधारित प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करते हैं 11,12,13. जबकि प्रोटीन की गति और पार्श्व प्रसार झिल्ली में प्रोटीन के स्थानीय घनत्व पर निर्भर करता है, व्यक्तिगत प्रोटीन अणुओं को लिपिड राफ्ट14 और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन15,16 में भी फंसाया जा सकता है। झिल्ली से बाह्य वातावरण या साइटोसोल में फैले प्रोटीन डोमेन के आधार पर, प्रोटीन गतिशीलता अत्यधिक मोबाइल से पूरी तरह से गतिहीन तक भिन्न हो सकती है। हालांकि, झिल्ली और इसकी परिधीय संरचनाओं की जटिलता के कारण, पार्श्व गतिशीलता और प्रोटीन फ़ंक्शन17 की प्रकृति के बीच परस्पर क्रिया को समझना अक्सर मुश्किल होता है।
डीआईबी झिल्ली झिल्ली प्रोटीन18,19,20,21,22 के बायोफिज़िकल एकल-अणु विश्लेषण के लिए एक कुशल मंच साबित हुआ है। तेल चरण में हाइड्रोगेल-समर्थित सब्सट्रेट्स के साथ जलीय बूंदों के संपर्क के माध्यम से लिपिड स्व-असेंबली द्वारा बनाए जाते हैं। आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) 1,23,24,25 के समान, डीआईबी उपयुक्त लिगेंड 17 के साथ कार्यात्मक होने पर बहुलक मैट्रिक्स में प्रोटीन के अस्थायी या स्थायी बंधन द्वारा पार्श्व गतिशीलता की स्थानीय ट्यूनिंग की अनुमति देता है। उत्तरार्द्ध एक विषम प्रोटीन वितरण 10 के साथ कोशिका झिल्ली में जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में काम करसकता है।
यहां वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके झिल्ली2,22 के निकट निकटता में अलग-अलग चैनलों के माध्यम से सीए2 + आयन प्रवाह को मापने के लिए सीए2 + संवेदनशील रंगों की प्रतिदीप्ति पर निर्भर करता है। यह ऑप्टिकल दृष्टिकोण नमूने की रोशनी को झिल्ली के करीब एक दूरी तक सीमित करता है, जो कि एवेनेसेंट उत्तेजना प्रकाश के भौतिक गुणों के कारण, प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि की महत्वपूर्ण कमी की ओर जाता है। उत्तरार्द्ध एक शर्त है यदि एकल अणुओं का पता लगाने के लिए उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प की आवश्यकता होती है। शास्त्रीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विधियों26,27 के विपरीत, व्यक्तिगत चैनलों के माध्यम से आयन प्रवाह का अध्ययन करने के लिए कोई झिल्ली वोल्टेज की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, विधि को फ्लोरोसेंट रंजक या अणुओं के साथ लेबलिंग की आवश्यकता नहीं होती है जो झिल्ली में चैनलों के पार्श्व आंदोलन में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
शास्त्रीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग किए बिना एकल अणु स्तर पर झिल्ली में एम्बेडेड प्रोटीन चैनलों का अध्ययन करने के लिए विधि विशेष रूप से उपयोगी है। न्यूरोस्पोरा क्रैसा28,29,30 और ओएमपीएफ से माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन-संचालन चैनल टीओएम-सीसी का उपयोग करते हुए, जो एस्चेरिचिया कोलाई17,31 की बाहरी झिल्ली में छोटे हाइड्रोफिलिक अणुओं के प्रसार का समर्थन करता है, हम बताते हैं कि दो प्रोटीनों की झिल्ली मोबिलिटी और चैनल गतिविधियों का अध्ययन और सहसंबद्ध कैसे किया जा सकता है। हम सुझाव देते हैं कि यह दृष्टिकोण, हालांकि टीओएम-सीसी और ओएमपीएफ के लिए अनुकूलित है, अन्य प्रोटीन चैनलों पर आसानी से लागू किया जा सकता है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एकल-अणु टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पार्श्व आयन चैनल आंदोलन और चैनल फ़ंक्शन के बीच परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए डीआईबी झिल्ली के उपयोग का परिचय प्रदान करता है। सर्वोत्तम संभव डेटा प्राप्त करने के लिए, अलग-अलग कणों की समय श्रृंखला प्राप्त करने के लिए यथासंभव कई अच्छी तरह से अलग चैनलों के साथ स्थिर डीआईबी झिल्ली की तैयारी महत्वपूर्ण है, जिसका संतोषजनक विश्लेषण किया जा सकता है।
अनुकूलित किए जाने वाले महत्वपूर्ण मापदंडों में लिपिड की पसंद, तेल चरण में लिपिड एकाग्रता और जलीय बूंदों में प्रोटीन और डिटर्जेंट सांद्रता शामिल हैं। नियोजित लिपिड असामान्य हैं, जिसमें वे कम तापमान पर कोई स्पष्ट चरण संक्रमण नहीं दिखाते हैं। डीपीएचपीसी स्थिर झिल्ली प्रणाली40 का उत्पादन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला लिपिड है। सिद्धांत रूप में, कोई भी लिपिड जो कम तापमान पर अपने द्रव वातावरण को बनाए रखता है, इस आवेदन के लिए उपयुक्त हो सकता है। इसके अलावा, लिपिड ऑक्सीकरण के प्रति संवेदनशील नहीं होना चाहिए। झिल्ली टूटने से बचने के लिए बूंदों में डिटर्जेंट एकाग्रता जितना संभव हो उतना कम होना चाहिए। स्थिर झिल्ली और अच्छी प्रोटीन निगमन दर आम तौर पर महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता (सीएमसी) से नीचे डिटर्जेंट सांद्रता के साथ प्राप्त की जाती है, यह देखते हुए कि झिल्ली प्रोटीन अवक्षेपित नहीं होता है।
यदि डीआईबी झिल्ली विशिष्ट डिटर्जेंट21,41 को सहन नहीं करती है, या यदि प्रोटीन डीआईबी झिल्ली में कम डिटर्जेंट समाधान से एकीकृत नहीं होते हैं, तो प्रोटीन चैनलों को पहले छोटे यूनिलैमेलर लिपिड पुटिकाओं (एसयूवी) में पुनर्गठित किया जा सकता है, जो बाद में बूंद पक्ष से डीआईबी झिल्ली से जुड़े होते हैं, जैसा कि ई कोलाई एमएससीएल42 के लिए सफलतापूर्वक दिखाया गया है। . कभी-कभी, डीआईबी झिल्ली नहीं बनती है क्योंकि तेल चरण में लिपिड एकाग्रता बहुत कम होती है। डीआईबी झिल्ली को फटने से रोकने के लिए, किसी को यह भी पता होना चाहिए कि हाइड्रोगेल और बूंद के बीच आसमाटिक दबाव को सीआईएस से ट्रांस तक सीए2 + -फ्लक्स को प्रभावित किए बिना ठीक से संतुलित किया जाना चाहिए। झिल्ली प्रोटीन के प्रसार का निरीक्षण करने के लिए अनुकूलित अगारोस मोटाई और जाल का आकार महत्वपूर्ण प्रतीत होता है। अगारोस परत के किसी भी सूखने से बचा जाना चाहिए। मोटाई परमाणु बल माइक्रोस्कोपी17 का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है। स्पिन कोटिंग के दौरान अगारोस एकाग्रता, मात्रा और रोटेशन गति को बदलकर, हाइड्रोगेल के जाल आकार और मोटाई को अनुकूलित किया जा सकता है। ध्यान दें, हालांकि, हाइड्रोगेल परत की मोटाई छवि कंट्रास्ट को प्रभावित करती है। डीआईबी में झिल्ली प्रोटीन को पकड़ने के लिए, अगारोस हाइड्रोगेल को कस्टम-संश्लेषित, गैर-क्रॉसलिंक्ड, नी-एनटीए-संशोधित, कम पिघलने वाले अगारोस द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है ताकि उन्हें हिस-टैग17 के माध्यम से फंसाया जा सके। अत्यधिक उच्च प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि अक्सर डीआईबी झिल्ली के टूटने के कारण होती है। यह विशेष रूप से बहु-कुएं कक्षों के साथ एक समस्या है, क्योंकि सीए2 + संवेदनशील डाई हाइड्रोगेल में फैलती है। इस मामले में, आसन्न कुओं से बचना चाहिए। झिल्ली के ऊपर सीए2 + संवेदनशील डाई की प्रतिदीप्ति विरंजन एक महत्वपूर्ण सीमित कारक नहीं होना चाहिए, क्योंकि यह टीआईआरएफ एवेनेसेंट क्षेत्र के बाहर बूंद (चित्रा 3 ए) के थोक में उत्तेजित रंगों द्वारा आदान-प्रदान किया जाता है। प्रोटीन के लिए स्थानीयकरण परिशुद्धता धब्बे और पिक्सेल आकार को फिट करने की सटीकता द्वारा दी जाती है।
कमजोर प्रतिदीप्ति संकेत चैनल के माध्यम से कम सीए2 + -फ्लक्स के कारण हो सकते हैं। संभावित कारणों में शामिल हैं: (i) गलत टीआईआरएफ सेटिंग्स (जैसे, लेजर तीव्रता), (ii) झिल्ली के पार आसमाटिक सीए2 + दबाव, या (iii) चैनलों की आंतरिक सीए2 + -पारगम्यता बहुत कम है। पहले मुद्दे से निपटने के लिए, लेजर तीव्रता, टीआईआरएफ कोण और कैमरा लाभ को अनुकूलित करने की आवश्यकता है। बाद के दो मुद्दों को झिल्ली 2,43 में एक विद्युत क्षमता के आवेदन से दूर किया जा सकता है। हालांकि, बाहरी वोल्टेज का अनुप्रयोग परिणाम को विकृत कर सकता है, क्योंकि विद्युत प्रभाव लिगैंड-गेटेड या मेकेनोसेंसिटिव आयन चैनलों के चैनल खोलने को प्रभावित कर सकते हैं जो वास्तव में वोल्टेज-नियंत्रित नहीं हैं। ऐसे चैनलों के उदाहरण माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन ट्रांसलोकेस टीओएम-सीसी27, और इसके चैनल बनाने वाले सबयूनिट टॉम 40 26,44,45,46 हैं। अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, वांछित कार्यक्षमता प्राप्त करने के लिए एक विशिष्ट अभिविन्यास में डीआईबी झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन डालना मुश्किल है, और मात्रात्मक अध्ययन दुर्लभ47,48 हैं। कुछ मामलों में, एकीकृत प्रोटीन का अभिविन्यास यादृच्छिक है। यह झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक गंभीर समस्या है, क्योंकि कुछ झिल्ली प्रोटीन झिल्ली के केवल एक तरफ सक्रिय होते हैं।
टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी प्लानर समर्थित झिल्ली49 में एकल-अणु घटनाओं को संबोधित करने के लिए एक शक्तिशाली विधि है। उदाहरणों में चैनल प्रोटीन जैसे α-हेमोलिसिन50, परफ्रिंगोलिसिन ओ51 और ओएमपीजी52 के संयोजन और फोल्डिंग मार्ग स्पष्टीकरण शामिल हैं। इन अध्ययनों में एक अतिरिक्त तकनीक के रूप में फ्रेट शामिल था। इसके अलावा, मेकेनोसेंसिटिव आयन चैनल एमएससीएल के सक्रियण का अध्ययन पहले वर्तमान माप का उपयोग करके समर्थित डीआईबी बाइलेयर42 की यांत्रिक उत्तेजना द्वारा किया गया है। इस काम के आधार पर, भविष्य के अध्ययन यहां वर्णित मंच को एकल-अणु फ्रेट प्रयोगों के साथ जोड़ सकते हैं ताकि ऑप्टिकल तरीके से एकल-अणु स्तर पर मेकेनोसेंसिटिव चैनलों को संबोधितकिया जा सके। बूंद में बफर का इंजेक्शन, आंतरिक डीआईबी मोनोलेयर को खींचना, या अंतर्निहित हाइड्रोगेल के लिए व्यक्तिगत चैनलों के लक्षित बंधन का उपयोग न केवल यांत्रिक रूप से सक्रिय चैनलों के भौतिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जो झिल्ली तनाव और / या वक्रता का जवाब देते हैं जैसा कि एमएससीएल और एमएससीएस, दो-छिद्र डोमेन के + -चैनल, ट्रेक -1, ट्रेक -2, और टीआरएएके, और पीईज़ो (समीक्षा के लिए,53 देखें), लेकिन सेलुलर साइटोस्केलेटन के लिए स्थानीय बंधन भी, जैसा कि स्पर्श-संवेदनशील आयन चैनल एनओएमपीसी54,55 के लिए दिखाया गया है।
The authors have nothing to disclose.
हम प्रोटीन तैयार करने में मदद के लिए बीट नित्शके और व्यावहारिक चर्चाओं के लिए रॉबिन घोष, माइकल श्विकर्ट (स्टटगार्ट), और मैक्सिमिलन उलब्रिच (फ्रीबर्ग) को धन्यवाद देते हैं। इस काम को स्टटगार्ट रिसर्च सेंटर सिस्टम बायोलॉजी (एसआरसीएसबी) और बाडेन वुर्टेमबर्ग फाउंडेशन (बायोएफएमओ -6 से एसएन) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C | |
100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49 | Nikon | MRD01991 | TIRF microscope |
10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25 | Nikon | Microscope to assess DIB membrane formation | |
10x objective N.A. 0.25 | Nikon | MRL00102 | TIRF microscope |
40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55 | Nikon | Microscope to assess DIB membrane formation | |
488 nm laser, 100 mW | Visitron | TIRF microscope | |
Adhesive tape | |||
Äkta pure | Cytiva | Protein purification system | |
Bradford assay kit, Pierce | Thermo Fisher | 23236 | |
CaCl2 | Roth | 5239.2 | |
Chelax 100 resin | Biorad | 143-2832 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | MC1024452500 | |
Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO | Thermo Fisher | 87735 | |
DIB chamber | Custom made | PMMA chamber for DIB membranes | |
Digital power meter and energy console | Thorlabs | PM100D | Laser power meter |
Dimethyl sulfoxide | Roth | 4720.1 | |
Double distilled H2O | |||
Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope | Nikon | Microscope to assess DIB membrane formation | |
EDTA | Roth | 8042.2 | |
EMCCD camera iXon Ultra 897 | Andor | TIRF microscope | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 32205-M | |
Fixed angle rotor Ti70 | Beckman Coulter | ||
Fluo-8, CalciFluorTM | Santa Cruz Biotechnology | SC-362561 | Ca2+-sensitive dye |
French press cell disruption homogenizer | Igneus | Igneus 40000 psi | |
GFP filter | AHF | Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source | |
Glass capillaries | World Precision Instruments | 4878 | |
Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm | Roth | 1870.2 | |
Glycerol | Roth | 3783.2 | |
Hamilton syringe 10 mL | Roth | X033.1 | |
Hamilton syringe 100 mL | Roth | X049.1 | |
Hamilton syringe 500 mL | Roth | EY49.1 | |
Heating block | Eppendorf | Thermomixer comfort | |
Heating plate | Minitube | HT200 | |
Hepes | Roth | 9205.3 | |
Hexadcane | Sigma-Aldrich | 296317 | |
His Trap HP 1 mL | Cytiva | 29051021 | Ni-NTA column |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 1.04716.1000 | |
KCl | Honeywell | 10314243 | |
KLM spin coater | Schaefer Tec | SCV-10 | |
List medical L/M-3P-A vertical pipette puller | Artisan Technology Group | 57761-1 | |
Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
M8 Stereomicroscope | Wild | Stereomicrosope | |
Matlab | MathWorks | R2022a | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MicroFil pipette tips | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
N2 gas | |||
NaCl | Roth | 3957.1 | |
Nanoliter 2010 injector | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | |
n-dodecyl-b-D-maltoside | Glycon Biochemicals | D97002-C | |
Ni-NTA agarose, non-crosslinked | Cube Biotech | 124115393 | Custom made |
NIS-Elements AR software | Nikon | MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930 | Imaging software |
n-octyl-polyoxyethylene | Sigma-Aldrich | 40530 | |
O2 gas | |||
Phenylmethylsulfonyl fluoride | Roth | 6367.3 | |
Photodiode sensor Si, 400 – 1100 nm, 500 mW | Thorlabs | S130C | Sensor for laser power meter |
Plasma cleaner | Diener Electronics | Zepto | |
Preparative ultracentrifuge Optima | Beckman Coulter | ||
Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC | AHF | Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser | |
Resource Q 1 mL | Cytiva | 17117701 | Anion exchange column |
Silicon oil AR 20 | Sigma-Aldrich | 10836 | |
Sodium dodecyl sulfate | Roth | 2326.2 | |
Super LoLux camera | JVC | Stereomicrosope | |
Thermoshaker | Gerhardt | THL 500/1 | |
Ti-E Fluorescence microscope | Nikon | MEA53100 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 9090.3 | |
Tryptone | Roth | 8952.2 | |
Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | RK 100 | |
Vaccum pump | Vacuubrand | MD 4C NT | |
White light source for epifluorescence illumination (100 W) | Nikon | MBF72655 | TIRF microscope |
Yeast extract | Roth | 2363.2 | |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |