Utvärdering av autofaginivåer i två olika pankreascellmodeller med LC3-immunofluorescens
Summary
Målet med detta protokoll är att bestämma autofagiska nivåer i bukspottskörtelcancer och acinarceller i bukspottskörteln genom LC3-immunofluorescens och LC3-punktkvantifiering.
Abstract
Autofagi är en specialiserad katabol process som selektivt bryter ned cytoplasmatiska komponenter, inklusive proteiner och skadade organeller. Autofagi tillåter celler att fysiologiskt reagera på stressstimuli och därmed upprätthålla cellulär homeostas. Cancerceller kan modulera sina autofaginivåer för att anpassa sig till negativa tillstånd som hypoxi, näringsbrist eller skador orsakade av kemoterapi. Duktalt pankreas adenokarcinom är en av de dödligaste typerna av cancer. Pankreascancerceller har hög autofagiaktivitet på grund av transkriptionell uppreglering och posttranslationell aktivering av autofagiproteiner.
Här användes PANC-1-cellinjen som en modell av humana cancerceller i bukspottskörteln, och AR42J-acinarcellinjen i bukspottskörteln användes som en fysiologisk modell av mycket differentierade däggdjursceller. Denna studie använde immunofluorescensen av mikrotubuliassocierat protein light chain 3 (LC3) som en indikator på statusen för autofagiaktivering. LC3 är ett autofagiprotein som under basala förhållanden visar ett diffust fördelningsmönster i cytoplasman (känd som LC3-I i detta tillstånd). Autofagiinduktion utlöser konjugeringen av LC3 till fosfatidyletanolamin på ytan av nybildade autofagosomer för att bilda LC3-II, ett membranbundet protein som hjälper till att bilda och expandera autofagosomer. För att kvantifiera antalet märkta autofagiska strukturer användes programvaran FIJI med öppen källkod med hjälp av verktyget “3D Objects Counter”.
Måttet på autofagiska nivåer både i fysiologiska förhållanden och i cancerceller gör det möjligt för oss att studera moduleringen av autofagi under olika förhållanden såsom hypoxi, kemoterapibehandling eller knockdown av vissa proteiner.
Introduction
Makroautofagi (vanligen kallad autofagi) är en specialiserad katabol process som selektivt bryter ned cytoplasmatiska komponenter, inklusive proteiner och skadade organeller 1,2. Autofagi tillåter celler att fysiologiskt reagera på stressstimuli och därmed upprätthålla cellulär homeostas3. Under autofagi bildas en dubbelmembranvesikel: autofagosomen. Autofagosomen innehåller lastmolekylerna och driver dem till lysosomen för nedbrytning 1,4.
Autofagosomer dekoreras av det autofagiska proteinmikrotubuliassocierade proteinet light chain 3 (LC3)5. När autofagi inte induceras diffunderas LC3 i cytoplasman och kärnan i LC3-I-konformationen. Å andra sidan, när autofagi induceras, konjugeras LC3 med en fosfatidyletanolamin i membranet i de autofagiska strukturerna6. Denna nya LC3-konformation är känd som LC3-II1. LC3-konformationsskiftet orsakar förändringar i dess cellulära lokalisering och dess dodecylnatriumsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) migration, som kan detekteras med tekniker som immunofluorescens och western blot 5,7. På detta sätt är LC3-konjugering en nyckelhändelse i den autofagiska processen som kan användas för att mäta autofagisk aktivitet.
Acinarcellen i bukspottskörteln är en mycket differentierad cell som under friska förhållanden har en låg autofagi. Men under olika fysiologiska förhållanden eller under farmakologisk stimulering kan de aktivera autofagi. Därför är bestämningen av autofagiska nivåer i denna cellinje användbar för att studera de potentiella direkta eller indirekta effekterna av olika farmakologiska eller biologiska agens på autofagi 8,9.
Duktalt adenokarcinom i bukspottskörteln är en av de dödligaste typerna av cancer, med tanke på dess sena diagnos och dess höga kemoterapiresistens10. Pankreascancerceller har hög autofagiaktivitet på grund av transkriptionell uppreglering och posttranslationell aktivering av autofagirelaterade proteiner11. Pankreascancerceller kan justera sina autofaginivåer som svar på ogynnsamma förhållanden som hypoxi, näringsbrist eller kemoterapiinducerad skada11. Därför kan analys av autofaginivåerna i bukspottskörtelcancerceller hjälpa till att förstå hur de anpassar sig till olika miljöer och utvärdera effektiviteten av autofagimodulerande behandlingar.
Denna studie visar en metod för att utföra LC3-immunofluorescens i två distinkta pankreascellulära modeller. Den första modellen, PANC-1-celler, fungerade som en modell för pankreas duktalt adenokarcinom. Dessa celler behandlades med gemcitabin, ett kemoterapimedel som tidigare har visat sig inducera autofagi, särskilt i bukspottskörtelcancerceller som bär den onkogena Kirsten rat sarkomvirusgenen (KRAS)12,13. Den andra modellen, AR42J-celler, fungerade som en mer fysiologisk modell av exokrina bukspottskörtelceller. Dessa celler differentierades med dexametason för att bli mer lik acinar pankreasceller14. I dessa celler inducerades autofagi farmakologiskt genom användning av PP242, som är en potent mTOR-hämmare15. I denna studie demonstrerar vi tillämpligheten av protokollet som beskrivs med två olika bukspottkörtelmodeller och dess förmåga att skilja mellan tillstånd av låg och hög autofagi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som beskrivs i detta protokoll gör det möjligt att visualisera den endogena LC3-fördelningen i cellen och kvantifiera de autofagiska nivåerna under olika förhållanden. En annan liknande metod som används för att analysera LC3-fördelningen och bestämma autofagiaktivering involverar fluorescensmärkt LC3-transfektion (såsom RFP-LC3)19. RFP-LC3-transfektion har fördelarna med att inte behöva fixeras (vilket gör det möjligt att tillämpa denna metod i levande cellavbildning<sup …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från University of Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), National Council for Scientific Research and Technology (CONICET) (PIP 2021-2023 GI − 11220200101549CO; och PUE 22920170100033) och National Agency for Scientific and Technological Promotion (PICT 2019-01664).
Materials
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
- Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
- Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. Digesting the expanding mechanisms of autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).
- Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. LC3 and autophagy. Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
- Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).
- Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
- Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. Pancreatic cancer. Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).
- Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
- Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).
- Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
- Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
- Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. Chapter 9 – Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
- Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
- Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
- Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and measuring autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).
- Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504 (2021).
- Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
- Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305 (2020).
- Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
