डेल्टा एंडोसाइटोसिस को ट्रैक करने के लिए एंटीबॉडी अपटेक परख जेब्राफिश रेडियल ग्लिया पूर्वजों के असममित विभाजन के दौरान
Summary
यह काम भ्रूण जेब्राफिश मस्तिष्क के रेडियल ग्लिया पूर्वजों को विभाजित करने में इंट्रा-वंशावली नॉच / डेल्टाडी सिग्नलिंग की इमेजिंग के लिए एक एंटीबॉडी अपटेक परख विकसित करता है।
Abstract
असममित कोशिका विभाजन (एसीडी), जो विभिन्न भाग्य की दो बेटी कोशिकाओं का उत्पादन करता है, सेलुलर विविधता उत्पन्न करने के लिए मौलिक है। अकशेरुकी और कशेरुकी दोनों के विकासशील अंगों में, असमान रूप से विभाजित पूर्वज एक नॉचहाय आत्म-नवीनीकरण और एक नॉचलो विभेदक बेटी उत्पन्न करते हैं। भ्रूण जेब्राफिश मस्तिष्क में, रेडियल ग्लिया पूर्वज (आरजीपी) – प्रमुख कशेरुक तंत्रिका स्टेम कोशिकाएं – ज्यादातर एक आरजीपी और एक विभेदक न्यूरॉन को जन्म देने के लिए एसीडी से गुजरती हैं। जेब्राफिश भ्रूण की ऑप्टिकल स्पष्टता और आसान पहुंच उन्हें विवो टाइम-लैप्स इमेजिंग में सीधे कल्पना करने के लिए आदर्श बनाती है कि एसीडी के दौरान नॉच सिग्नलिंग की विषमता कैसे और कब स्थापित होती है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि नॉच लिगैंड डेल्टाडी का गतिशील एंडोसाइटोसिस एसीडी के दौरान सेल भाग्य निर्धारण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और इस प्रक्रिया को क्रमिक रूप से संरक्षित ध्रुवीयता नियामक पार -3 (जिसे पार्ड 3 के रूप में भी जाना जाता है) और डायनेन मोटर कॉम्प्लेक्स द्वारा नियंत्रित किया जाता है। माइटोटिक आरजीपी में नॉच सिग्नलिंग एंडोसोम के विवो तस्करी पैटर्न की कल्पना करने के लिए, हमने इस एंटीबॉडी अपटेक परख को विकसित किया है। परख का उपयोग करते हुए, हमने आरजीपी डिवीजन के दौरान डेल्टाडी युक्त एंडोसोम की गतिशीलता को उजागर किया है।
Introduction
नॉच सिग्नलिंग मेटाज़ोन्स1 में विकास के दौरान सेल भाग्य निर्णय और पैटर्निंग को नियंत्रित करता है, और हाल के अध्ययनों से पता चला है कि स्टेम सेल डिवीजन में नॉच सिग्नलिंग मुख्य रूप से एंडोसाइटिक ट्रैफिकिंग 2,3 पर निर्भर करता है। डेल्टा नाभिक में नॉच सिग्नलिंग को सक्रिय कर सकता है और नॉच लक्ष्य जीन 4,5,6 के प्रतिलेखन को बढ़ा सकता है। डेल्टा एंडोसोमल तस्करी को पहली बार ड्रोसोफिला संवेदी अंग अग्रदूत (एसओपी) कोशिकाओं में इसके असममित कोशिका विभाजन (एसीडी) के दौरान देखा गया था, जिसके परिणामस्वरूप पीआईबी 7,8 की तुलना में पीआईए में उच्च नॉच सिग्नलिंग गतिविधि देखी गई थी। माइटोटिक एसओपी कोशिकाओं में एंडोसाइटिक प्रक्रिया की निगरानी के लिए एंटी-डेल्टा और एंटी-नॉच एंटीबॉडी के साथ एंटीबॉडी अपटेक परख लागू की गई है। डेल्टाडी एंडोसोम साइटोकिनेसिस के दौरान केंद्रीय स्पिंडल में एक किन्सिन मोटर प्रोटीन के साथ चलते हैं, और कोशिका विभाजन 3,8 के अंतिम क्षण में असममित केंद्रीय स्पिंडल की एंटीपैरेलल सरणी के कारण पीआईए सेल में असममित रूप से स्थानांतरित हो जाते हैं। इन अध्ययनों ने ड्रोसोफिला एसओपी कोशिकाओं में असममित विभाजन को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र पर प्रकाश डाला है, लेकिन यह स्पष्ट नहीं है कि कशेरुक रेडियल ग्लिया पूर्वजों (आरजीपी) में इसी तरह की एंडोसाइटिक प्रक्रियाएं होती हैं या नहीं।
इसके अलावा, कशेरुक आरजीपी विभाजन के दौरान असममित नॉच / डेल्टाडी सिग्नलिंग को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। जेब्राफिश में, यह बताया गया है कि नॉच और डेल्टा की बातचीत डेल्टाडी लिगैंड9 के एंडोसाइटोसिस की सुविधा प्रदान करती है। यह अज्ञात है कि क्या डेल्टाडी एंडोसाइटोसिस विकासशील कशेरुक मस्तिष्क में बेटी कोशिकाओं की कोशिका भाग्य पसंद को प्रभावित कर सकता है। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि न्यूरल ट्यूब में फ्लोरोसेंटली संयुग्मित एंटी-डेल्टाडी एंटीबॉडी इंजेक्ट करने से सारा एंडोसोम को विशेष रूप से न्यूरोएपिथेलियल कोशिकाओं में लेबल किया जा सकता है, और एंटी-डेल्टाडी युक्त सारा एंडोसोम अधिमानतःबेटी कोशिकाओं के प्रसार में अलग हो सकते हैं। यह सुझाव दिया गया है कि एंडोसोम से नॉच सिग्नलिंग बेटी सेल भाग्य को नियंत्रित कर सकती है। पिछले परिणामों से पता चला है कि विकासशील फोरब्रेन में अधिकांश जेब्राफिश आरजीपी कोशिकाएं एसीडी से गुजरती हैं, और बेटी सेल भाग्य निर्धारण इंट्रावंशावली नॉच / डेल्टाडी सिग्नलिंग11 पर निर्भर है। जेब्राफिश आरजीपी में इंट्रावंशावली नॉच / डेल्टाडी सिग्नलिंग की प्रकृति को स्पष्ट करने के लिए, हमने जेब्राफिश विकासशील मस्तिष्क में एंटी-डेल्टाडी एंटीबॉडी अपटेक परख विकसित की है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने माइटोटिक आरजीपी में डेल्टाडी एंडोसाइटिक तस्करी के लाइव लेबलिंग और इमेजिंग का सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया है।
फ्लोरोसेंटली लेबल एंटी-डेल्टाडी-एंटीबॉडी को फोरब्रेन वेंट्रिकल के साथ आरजीपी में कुशलतापूर्वक आंतरिक रूप से आंतरिक किया जाता है। इसने असममित रूप से विभाजित आरजीपी12,13 में डेल्टाडी एंडोसोम की दिशात्मक तस्करी की खोज को बहुत सुविधाजनक बनाया है। ड्रोसोफिला नोटम संस्कृतियों और जेब्राफिश रीढ़ की हड्डी 10 के लिए विकसित पिछले एंटीबॉडी अपटेक प्रोटोकॉल की तुलना में, इस प्रोटोकॉल ने मस्तिष्क वेंट्रिकल सेल परत में लंबे समय तक चलने वाले और अत्यधिक कुशल एंटी-डेल्टाडी लेबलिंग हासिल की है, विशेष रूप से10 एनएल से कम माइक्रोइंजेक्टेड एंटीबॉडी मिश्रण के साथ। हिंडब्रेन वेंट्रिकल इंजेक्शन विकासशील मस्तिष्क में एंटीबॉडी अपटेक परख को लागू करने के लिए बहुत सुविधाजनक है, क्योंकि हिंडब्रेन वेंट्रिकल जेब्राफिश भ्रूण में अच्छी तरह से विस्तारित होता है और प्रारंभिक विकास चरण14 में मस्तिष्कमेरु द्रव से भर जाता है। किसी भी महत्वपूर्ण विकासशील ऊतकों को घायल किए बिना हिंडब्रेन वेंट्रिकल में एंटीबॉडी मिश्रण को इंजेक्ट करके, प्रोटोकॉल ने फोरब्रेन में इमेजिंग ज़ोन को यथासंभव संभावित नुकसान को कम कर दिया है। इंजेक्शन वाले प्राथमिक एंटीबॉडी की कम खुराक ने विवो में अंतर्जात डेल्टा-नॉच सिग्नलिंग में हस्तक्षेप करने के संभावित दुष्प्रभावों से भी बचा है। इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य औषधीय या आनुवंशिक गड़बड़ी के साथ जोड़ा जा सकता है, जिसका उपयोग विभिन्न विकास चरणों में किया जाता है, और संभवतः वयस्क मस्तिष्क के साथ-साथ मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न 2 डी / 3 डी मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स के लिए अनुकूलित किया जाता है। एक साथ लिया गया, प्रोटोकॉल ने यह समझना संभव बना दिया है कि एसीडी के दौरान नॉच सिग्नलिंग विषमता कैसे और कब स्थापित होती है। इस प्रोटोकॉल के सफल कार्यान्वयन के लिए मुख्य चुनौती विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर एंटीबॉडी की उचित सांद्रता के सटीक वितरण को प्राप्त करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने उच्च दक्षता के साथ जेब्राफिश रेडियल ग्लिया पूर्वजों में एंडोसोमल नॉच / डेल्टा तस्करी को लेबल करने और इमेजिंग करने के लिए एक एंटीबॉडी अपटेक परख विकसित की है। ड्रोसोफिला एसओपी कोशिकाओं7,8 म…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना को एनआईएच आर 01एनएस 120218, यूसीएसएफ मैरी ऐनी कोडा-किम्बल सीड अवार्ड फॉर इनोवेशन और चान जुकरबर्ग बायोहब द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
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