Detta arbete utvecklar en antikroppsupptagsanalys för avbildning av intra-lineage Notch / DeltaD-signalering i delande radiella glia-förfäder till den embryonala zebrafiskhjärnan.
Asymmetrisk celldelning (ACD), som producerar två dotterceller av olika öden, är grundläggande för att generera cellulär mångfald. I utvecklingsorganen hos både ryggradslösa djur och ryggradsdjur genererar asymmetriskt delande förfäder en Notchhej självförnyande och en Notchlo differentierande dotter. I den embryonala zebrafiskhjärnan genomgår radiella glia-progenitorer (RGP) – de viktigaste neurala stamcellerna hos ryggradsdjur – mestadels ACD för att föda en RGP och en differentierande neuron. Den optiska klarheten och lättillgängligheten hos zebrafiskembryon gör dem idealiska för de vivo-time-lapse-avbildning för att direkt visualisera hur och när asymmetrin i Notch-signalering etableras under ACD. Nya studier har visat att dynamisk endocytos av Notch-liganden DeltaD spelar en avgörande roll vid bestämning av cellens öde under ACD, och processen regleras av den evolutionärt bevarade polaritetsregulatorn Par-3 (även känd som Pard3) och dyneinmotorkomplexet. För att visualisera in vivo-handelsmönstren för Notch-signalendosomer i mitotiska RGP har vi utvecklat denna antikroppsupptagsanalys. Med hjälp av analysen har vi upptäckt dynamiken hos DeltaD-innehållande endosomer under RGP-delning.
Notch-signalering styr cellens ödesbeslut och mönster under utvecklingen i metazoans1, och nyligen genomförda studier har visat att Notch-signalering vid stamcellsdelning huvudsakligen beror på endocytisk handel 2,3. Endocytosed Notch / Delta kan aktivera Notch-signalering i kärnan och förbättra transkriptionen av Notch-målgener 4,5,6. Riktad Notch/Delta endosomal trafficking observerades först i Drosophila sensoriska organprekursorceller (SOP) under dess asymmetriska celldelning (ACD), vilket resulterade i en högre Notch-signaleringsaktivitet i pIIa än i pIIb 7,8. Antikroppsupptagsanalyser med anti-Delta- och anti-Notch-antikroppar har tillämpats för att övervaka den endocytiska processen i mitotiska SOP-celler. Notch/DeltaD-endosomer rör sig tillsammans med ett kinesinmotoriskt protein till den centrala spindeln under cytokinese och translokeras asymmetriskt in i pIIa-cellen på grund av den asymmetriska centralspindelns antiparallella uppsättning i det sista ögonblicket av celldelning 3,8. Dessa studier har belyst de molekylära mekanismerna som reglerar asymmetrisk delning i Drosophila SOP-celler, men det är oklart om liknande endocytiska processer förekommer hos ryggradsdjur radiella glia progenitorer (RGP).
Dessutom är de molekylära mekanismerna som reglerar asymmetrisk Notch / DeltaD-signalering under ryggradsdjur RGP-delning inte väl förstådda. I zebrafisk har det rapporterats att interaktionen mellan Notch och Delta underlättar endocytosen hos DeltaD-liganden9. Det är okänt om DeltaD-endocytos kan påverka cellens öde val av dotterceller i den utvecklande ryggradsdjurhjärnan. Nya studier visar att injicera fluorescerande konjugerade anti-DeltaD-antikroppar i neuralröret kan märka Sara-endosomer specifikt i neuroepitelceller, och anti-DeltaD innehållande Sara-endosomer segregerar företrädesvis till prolifererande dotterceller10. Det har föreslagits att Notch-signalering från endosomerna skulle kunna reglera dottercellens öde. Tidigare resultat har visat att de flesta zebrafisk RGP-celler i den utvecklande framhjärnan genomgår ACD, och dottercellens ödesbestämning är beroende av intralineage Notch / DeltaD-signalering11. För att belysa karaktären av intralineage Notch / DeltaD-signalering i zebrafisk RGPs har vi utvecklat anti-DeltaD-antikroppsupptagsanalysen i zebrafiskens utvecklande hjärna. Med hjälp av detta protokoll har vi framgångsrikt utfört livemärkning och avbildning av DeltaD-endocytisk handel i mitotiska RGP.
Den fluorescerande märkta anti-DeltaD-antikroppen internaliseras effektivt i RGP: erna längs framhjärnkammaren. Det har i hög grad underlättat upptäckten av riktad handel med DeltaD-endosomer i de asymmetriskt delande RGP: erna12,13. Jämfört med tidigare antikroppsupptagsprotokoll som utvecklats för Drosophila notum-kulturer och zebrafiskryggmärgen 10, har detta protokoll uppnått långvarig och mycket effektiv anti-DeltaD-märkning i hjärnventrikelcellskiktet, specifikt med mindre än10 nL mikroinjicerad antikroppsblandning. Injektionen av bakhjärnans ventrikel är mycket lämplig för att applicera antikroppsupptagsanalysen i den utvecklande hjärnan, eftersom bakhjärnans ventrikel är väl expanderad i zebrafiskembryon och fylld med cerebrospinalvätska i tidigt utvecklingsstadium14. Genom att injicera antikroppsblandningen i bakhjärnans kammare utan att skada några viktiga utvecklingsvävnader har protokollet minimerat eventuella skador på avbildningszonen i framhjärnan så mycket som möjligt. Den reducerade dosen av den injicerade primära antikroppen har också undvikit potentiella biverkningar av att störa endogen Delta-Notch-signalering in vivo. Detta protokoll kan enkelt kombineras med andra farmakologiska eller genetiska störningar, som används i olika utvecklingsstadier, och möjligen anpassas till den vuxna hjärnan såväl som humana pluripotenta stamcellshärledda 2D/3D-hjärnorganoider. Sammantaget har protokollet gjort det möjligt att förstå hur och när Notch-signalasymmetri etableras under ACD. Den största utmaningen för ett framgångsrikt genomförande av detta protokoll är att uppnå exakt leverans av lämpliga koncentrationer av antikroppen baserat på specifika experimentella förhållanden.
Vi har utvecklat en antikroppsupptagsanalys för märkning och avbildning av endosomal Notch / Delta-handel i zebrafisk radiella glia-förfäder med hög effektivitet. Jämfört med tidigare metoder som använts för att spåra märkt anti-DeltaD-antikropp i Drosophila SOP-celler7,8, använde vår metod mikroinjektion istället för inkubation av prover i den konjugerade antikroppen. Fluorescerande konjugerade anti-DLD-antikroppar mikroinjicerades i bakhjärnans …
The authors have nothing to disclose.
Projektet stöddes av NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation och Chan Zuckerberg Biohub.
35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
air pressure injector | Narishige | IM300 | |
Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
KCl | Millipore | 529552 | |
MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |