बायोइंजीनियरिंग के लिए ऑन-चिप ऑक्टानोल-असिस्टेड लिपोसोम असेंबली
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल में ऑक्टानॉल-असिस्टेड लिपोसोम असेंबली (ओएलए) का वर्णन किया गया है, जो बायोकम्पैटिबल लिपोसोम उत्पन्न करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक है। ओला कुशल एनकैप्सुलेशन के साथ मोनोस्प्रेड, माइक्रोन-आकार के लिपोसोम का उत्पादन करता है, जिससे तत्काल ऑन-चिप प्रयोग की अनुमति मिलती है। यह प्रोटोकॉल सिंथेटिक जीव विज्ञान और सिंथेटिक सेल अनुसंधान के लिए विशेष रूप से उपयुक्त होने की उम्मीद है।
Abstract
माइक्रोफ्लुइडिक्स एक नियंत्रित और उच्च-थ्रूपुट तरीके से विभिन्न प्रकार की बूंदों और पुटिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला उपकरण है। लिपोसोम ्स एक लिपिड बाइलेयर से घिरे एक जलीय इंटीरियर से बने सरल सेलुलर मिमिक्स हैं; वे सिंथेटिक कोशिकाओं को डिजाइन करने और इन विट्रो फैशन में जैविक कोशिकाओं के मूल सिद्धांतों को समझने में मूल्यवान हैं और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए कार्गो डिलीवरी जैसे लागू विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह लेख एक ऑन-चिप माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक, ऑक्टानोल-असिस्टेड लिपोसोम असेंबली (ओएलए) के लिए एक विस्तृत कार्य प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो मोनोस्प्रेड, माइक्रोन-आकार, बायोकंपैटिबल लिपोसोम का उत्पादन करता है। ओला बबल ब्लोइंग के समान कार्य करता है, जहां एक आंतरिक जलीय (आईए) चरण और आसपास के लिपिड-ले जाने वाले 1-ऑक्टानॉल चरण को सर्फेक्टेंट युक्त बाहरी द्रव धाराओं द्वारा काट दिया जाता है। यह आसानी से उभरे हुए ऑक्टानॉल जेब के साथ डबल-इमल्शन बूंदें उत्पन्न करता है। जैसे ही लिपिड बाइलेयर ड्रॉपलेट इंटरफ़ेस पर इकट्ठा होता है, जेब अनायास एक यूनिलामेलर लिपोसोम को जन्म देने के लिए अलग हो जाती है जो आगे के हेरफेर और प्रयोग के लिए तैयार है। ओला कई फायदे प्रदान करता है, जैसे कि स्थिर लिपोसोम पीढ़ी (>10 हर्ट्ज), बायोमैटेरियल्स का कुशल एनकैप्सुलेशन, और मोनोस्प्रेटेड लिपोसोम आबादी, और बहुत छोटे नमूना वॉल्यूम (~ 50 μL) की आवश्यकता होती है, जो कीमती जैविकों के साथ काम करते समय महत्वपूर्ण हो सकता है। अध्ययन में माइक्रोफैब्रिकेशन, सॉफ्ट-लिथोग्राफी और सरफेस निष्क्रिय पर विवरण शामिल हैं, जो प्रयोगशाला में ओला प्रौद्योगिकी स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं। ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटॉन फ्लक्स के माध्यम से लिपोसोम के अंदर बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट के गठन को प्रेरित करके एक प्रूफ-ऑफ-प्रिंसिपल सिंथेटिक बायोलॉजी एप्लिकेशन भी दिखाया गया है। यह अनुमान लगाया गया है कि यह वीडियो प्रोटोकॉल पाठकों को अपनी प्रयोगशालाओं में ओला स्थापित करने और समस्या निवारण करने की सुविधा प्रदान करेगा।
Introduction
सभी कोशिकाओं में उनकी भौतिक सीमा के रूप में एक प्लाज्मा झिल्ली होती है, और यह झिल्ली अनिवार्य रूप से एम्फीफिलिक लिपिड अणुओं के स्व-संयोजन द्वारा गठित लिपिड बाइलेयर के रूप में एक मचान होती है। लिपोसोम जैविक कोशिकाओं के न्यूनतम सिंथेटिक समकक्ष हैं; उनके पास फॉस्फोलिपिड्स से घिरा एक जलीय लुमेन होता है, जो जलीय चरण का सामना करने वाले हाइड्रोफिलिक सिर समूहों और हाइड्रोफोबिक पूंछ के साथ एक लिपिड बाइलेयर बनाता है। लिपोसोम की स्थिरता हाइड्रोफोबिक प्रभाव के साथ-साथ ध्रुवीय समूहों के बीच हाइड्रोफिलिसिटी, हाइड्रोफोबिक कार्बन पूंछ के बीच वैन डेर वाल्स बलों और पानी के अणुओं और हाइड्रोफिलिक हेड्स 1,2 के बीच हाइड्रोजन बॉन्डिंग द्वारा नियंत्रित होती है। लिपिड बाइलेयर की संख्या के आधार पर, लिपोसोम को दो मुख्य श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है, अर्थात्, यूनिलामेलर पुटिकाओं में एक एकल बाईलेयर और मल्टीलैमेलर पुटिकाएं शामिल होती हैं जो कई बाइलेयर से निर्मित होती हैं। यूनिलामेलर पुटिकाओं को उनके आकार के आधार पर आगे वर्गीकृत किया जाता है। आमतौर पर आकार में गोलाकार, उन्हें विभिन्न आकारों में उत्पादित किया जा सकता है, जिसमें छोटे यूनिलामेलर पुटिकाएं (एसयूवी, 30-100 एनएम व्यास), बड़े यूनिलामेलर पुटिकाएं (एलयूवी, 100-1,000 एनएम व्यास), और अंत में, विशाल यूनिलामेलर पुटिकाएं (जीयूवी, >1,000 एनएम व्यास) 3,4 शामिल हैं। लिपोसोम का उत्पादन करने के लिए विभिन्न तकनीकों को विकसित किया गया है, और इन्हें मोटे तौर पर थोक तकनीक5 और माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक6 में वर्गीकृत किया जा सकता है। आमतौर पर प्रचलित थोक तकनीकों में लिपिड फिल्म पुनर्जलीकरण, इलेक्ट्रोफॉर्मेशन, उल्टे इमल्शन ट्रांसफर और एक्सट्रूज़न 7,8,9,10 शामिल हैं। ये तकनीकें अपेक्षाकृत सरल और प्रभावी हैं, और ये सिंथेटिक जीव विज्ञान समुदाय में उनके व्यापक उपयोग के प्रमुख कारण हैं। हालांकि, एक ही समय में, वे आकार में पॉलीडिस्पर्सिटी, लैमेलारिटी पर नियंत्रण की कमी और कम एनकैप्सुलेशन दक्षता 7,11 के संबंध में प्रमुख कमियों से पीड़ित हैं। निरंतर ड्रॉपलेट इंटरफेस क्रॉसिंग एनकैप्सुलेशन (सीडीआईसीई) 12 और ड्रॉपलेट शूटिंग और आकार निस्पंदन (डीएसएसएफ) 13 जैसी तकनीकें कुछ हद तक इन सीमाओं को दूर करती हैं।
माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण पिछले दशक में प्रमुखता से बढ़ रहे हैं। माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक विशिष्ट लामिनर प्रवाह और प्रसार-प्रभुत्व वाले द्रव्यमान हस्तांतरण के कारण उपयोगकर्ता-परिभाषित माइक्रोचैनल्स के भीतर द्रव प्रवाह में हेरफेर करने के लिए एक नियंत्रणीय वातावरण प्रदान करती है। परिणामी लैब-ऑन-ए-चिप डिवाइस अणुओं के स्थानिक नियंत्रण के लिए अद्वितीय संभावनाएं प्रदान करते हैं, जिसमें नमूना मात्रा और मल्टीप्लेक्सिंगक्षमताओं में काफी कमी आती है। लिपोसोम बनाने के लिए कई माइक्रोफ्लुइडिक तरीके विकसित किए गए हैं, जिनमें स्पंदित जेटिंग 15, डबल इमल्शन टेमप्लेटिंग 16, क्षणिक झिल्ली इजेक्शन17, ड्रॉपलेट इमल्शन ट्रांसफर 18 और हाइड्रोडायनामिक फोकसिंग 19 शामिल हैं। ये तकनीकें उच्च एनकैप्सुलेशन दक्षता और उच्च थ्रूपुट के साथ मोनोस्प्रेड, यूनिलामेलर, सेल के आकार के लिपोसोम का उत्पादन करती हैं।
यह लेख ऑक्टानोल-असिस्टेड लिपोसोम असेंबली (ओएलए) के लिए प्रक्रिया का विवरण देता है, जो हाइड्रोडायनामिक पिंच-ऑफ और बाद में विलायक डीवेटिंग तंत्र20 (चित्रा 1) पर आधारित एक ऑन-चिप माइक्रोफ्लुइडिक विधि है। कोई भी ओला के कामकाज को बुलबुला उड़ाने की प्रक्रिया से जोड़ सकता है। एक छह-तरफा जंक्शन एक ही स्थान पर आंतरिक जलीय (आईए) चरण, दो लिपिड-ले जाने वाले कार्बनिक (एलओ) धाराओं और दो सर्फेक्टेंट-युक्त बाहरी जलीय (ओए) धाराओं को केंद्रित करता है। इसके परिणामस्वरूप पानी में (लिपिड + ऑक्टानॉल)-इन-वाटर डबल इमल्शन बूंदें होती हैं। चूंकि ये बूंदें नीचे की ओर बहती हैं, इंटरफेशियल ऊर्जा न्यूनीकरण, बाहरी कतरनी प्रवाह और चैनल की दीवारों के साथ बातचीत से इंटरफ़ेस पर एक लिपिड बाइलेयर का निर्माण होता है क्योंकि विलायक जेब अलग हो जाती है, इस प्रकार यूनिलामेलर लिपोसोम ्स बनते हैं। ऑक्टानोल जेब के आकार के आधार पर, डीवेटिंग प्रक्रिया में दसियों सेकंड से कुछ मिनट लग सकते हैं। निकास चैनल के अंत में, कम घनी ऑक्टानॉल बूंदें सतह पर तैरती हैं, जबकि भारी लिपोसोम (एक सघन एनकैप्सुलेटेड समाधान के कारण) प्रयोग के लिए तैयार विज़ुअलाइज़ेशन कक्ष के तल पर डूब जाते हैं। एक प्रतिनिधि प्रयोग के रूप में, लिपोसोम के अंदर तरल-तरल चरण पृथक्करण (एलएलपीएस) की प्रक्रिया का प्रदर्शन किया जाता है। इसके लिए, आवश्यक घटकों को एक अम्लीय पीएच पर लिपोसोम के अंदर समझाया जाता है जो एलएलपीएस को रोकता है। बाहरी रूप से पीएच परिवर्तन को ट्रिगर करके और इस प्रकार, एक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटॉन फ्लक्स, लिपोसोम के अंदर चरण-अलग कंडेनसेट बूंदें बनती हैं। यह ओला प्रणाली की प्रभावी एनकैप्सुलेशन और हेरफेर क्षमताओं पर प्रकाश डालता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेलुलर जटिलता एक पूरे के रूप में अध्ययन किए जाने पर जीवित कोशिकाओं को समझना बेहद मुश्किल बनाती है। विट्रो में प्रमुख घटकों को पुनर्गठित करके कोशिकाओं के अतिरेक और इंटरकनेक्टिविटी को कम करना जैविक प्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम हमें वाईएफपी प्रदान करने के लिए डॉल्फ वीजर्स, वेरा गोरेलोवा और मार्क रूसजेन को धन्यवाद देना चाहते हैं। एसडी डच रिसर्च काउंसिल (अनुदान संख्या: OCENW) से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है। क्लेन.465)।
Materials
| 1-Octanol | Sigma-Aldrich | No. 297887 | |
| 1.5 mL tubes | Fisher scientific | 10451043 | Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes |
| ATP | Sigma-Aldrich | No. A2383 | |
| Biopsy punch | Darwin microfluidics | PT-T983-05 | 0.5 mm and 3 mm diameter |
| Citrate-base | Sigma-Aldrich | No. 71405 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | No. 31388 | Mr~6,000 |
| Direct-write optical lithography machine | Durham Magneto Optics Ltd | MicroWriter ML3 Baby | setup and software |
| DOPC lipid | Avanti | SKU:850375C | |
| F68 | Sigma-Aldrich | No. 24040032 | |
| Glass cover slip | Corning | #1, 24 x 40 mm | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | No. G2025 | |
| Hydrochloric acid | Thermo Scientific Acros | No. 124630010 | |
| Liss Rhod PE lipid | Avanti | SKU:810150C | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | No. P7793 | |
| Photoresist | Micro resist technology GmbH | EpoCore 10 | |
| Photoresist developer | micro resist technology GmbH | mr-Dev 600 | |
| Plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G | |
| Polydimethylsiloxane | Dow | Sylgard 184 | PDMS and curing agent |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | No. P7890 | |
| Poly-L-lysine–FITC Labeled | Sigma-Aldrich | No. P3543 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | no. P8136 | molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed |
| Pressure controller | Elveflow | OBK1 Mk3+ | Flow controller |
| Scotch tape | Magic Tape Invisible Matt Tape | ||
| Silicon wafer | Silicon Materials | 0620R16002 | |
| Spin coater | Laurell Technologies Corporation | Model WS-650MZ-23NPP | |
| Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers | Darwin microfluidics | PN-BEN-23G | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | No. 252859 | |
| Tygon tubing | Darwin microfluidics | 1/16" OD x 0.02" ID | |
| UV laser | 365 nm wavelength |
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