כאן, אנו מתארים פרוטוקול כללי ועיצוב שניתן ליישם כדי לזהות כמויות זעירות ומרכיבים קטנים בפורמולציות המוצר הטבעי המורכב (מטריצות) ברפואה הטיבטית.
תרופות טיבטיות הן מורכבות ומכילות תרכובות לא ידועות רבות, מה שהופך מחקר מעמיק על המבנים המולקולריים שלהן לחיוני. כרומטוגרפיה נוזלית-אלקטרוספריי יינון זמן טיסה ספקטרומטריית מסה (LC-ESI-TOF-MS) משמשת בדרך כלל לחילוץ רפואה טיבטית; עם זאת, תרכובות בלתי ידועות בלתי צפויות רבות נשארות לאחר השימוש במסד הנתונים ספקטרום. המאמר הנוכחי פיתח שיטה אוניברסלית לזיהוי רכיבים ברפואה הטיבטית באמצעות ספקטרומטריית מסות מלכודת יונים (IT-MS). השיטה כוללת פרוטוקולים סטנדרטיים ומתוכנתים להכנת דגימה, הגדרת MS, ריצת LC, הקמת שיטה, רכישת MS, הפעלת MS מרובת שלבים וניתוח נתונים ידני. שתי תרכובות מייצגות בתרופה הטיבטית Abelmoschus manihot seeds זוהו באמצעות פיצול רב-שלבי, עם ניתוח מפורט של מבנים מורכבים טיפוסיים. בנוסף, המאמר דן בהיבטים כגון בחירת מצב יונים, התאמת פאזה ניידת, אופטימיזציה של טווח הסריקה, בקרת אנרגיית התנגשות, החלפת מצב התנגשות, גורמי פיצול ומגבלות השיטה. שיטת הניתוח הסטנדרטית שפותחה היא אוניברסלית וניתן ליישם אותה על תרכובות לא ידועות ברפואה הטיבטית.
הניתוח האיכותני של יסודות קורט ברפואה הסינית המסורתית (TCM) הפך לנושא מכריע במחקר. בשל המספר הגבוה של תרכובות ב- TCM, קשה לבודד אותן לניתוח ספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית (NMR) או דיפרקטומטר קרני רנטגן (XRD), מה שהופך שיטות מבוססות ספקטרומטריית מסה (MS) הדורשות רק נפחי דגימה נמוכים לפופולריות יותר ויותר. בנוסף, כרומטוגרפיה נוזלית (LC) בשילוב עם טרשת נפוצה נמצאת בשימוש נרחב במחקר TCM בשנים האחרונות לשיפור ההפרדה של דגימות מורכבות וניתוח איכותי של תרכובות כימיות1. שיטה נפוצה אחת היא כרומטוגרפיה נוזלית-אלקטרוספריי יינון זמן טיסה ספקטרומטריית מסה (LC-ESI-TOF-MS), אשר נמצאת בשימוש נרחב במחקר איכותני על רפואה טיבטית2. בשיטה זו, רכיבים מורכבים מועשרים ומופרדים בטור LC, ויחס המסה למטען (m/z) של יוני האדוקט נצפה באמצעות גלאי MS. חיפוש במסדי נתונים טנדם MS (MS/MS או MS2) הוא כיום הגישה המהירה ביותר עבור ביאורים מורכבים בטוחים בניתוח מולקולות קטנות באמצעות זמן טיסה מרובע (Q-TOF) MS ו- Orbitrap MS3. עם זאת, האיכות הירודה של מסדי נתונים ונוכחותם של איזומרים שונים מעכבים זיהוי של תרכובות לא ידועות. בנוסף, המידע המסופק על ידי מסד הנתונים MS/MS מוגבל 4,5,6,7. חשוב לחקור את התרכובות הכימיות בכל TCM באמצעות פרוטוקול כללי שניתן ליישם באופן נרחב על TCM אחרים.
IT-MS לוכד מגוון רחב של יונים על ידי הפעלת מתחי תדר רדיו (RF) שונים על אלקטרודות טבעת8. IT-MS יכול לבצע סריקות MS מרובות שלבים מסדרות זמן בסדר כרונולוגי מגוון, ולספק פיצול מרובה שלבים של MS (MS n), כאשרn הוא מספר שלבי יוני המוצר9. IT-MS ליניארי נחשב הטוב ביותר לזיהוי מבנה מכיוון שניתן להשתמש בו לניסויים רציפיםשל MS n 10. ניתן לבודד יונים ממוקדים ולהצטבר ב-IT-MS1 ליניארי. MS n (n ≥ 3) ב- IT-MS מספק יותר מידע מקטע מאשר MS/MS ב- Q-TOF-MS. מכיוון ש- IT-MS אינו יכול לנעול את יון המטרה ואת יוני השבר שלו, זהו כלי רב עוצמה להבהרת מבנה של תרכובות לא ידועות, כולל איזומרים1. טכנולוגייתMS n יושמה באופן נרחב בניתוח מבני של חלבונים, פפטידים ורב-סוכרים לא ידועים11,12. רמת השפע של יוני פרגמנט ב-MSn מספקת יותר מידע על פרגמנטים מולקולריים על תרכובות ממוקדות בדגימות מורכבות מאשר MS/MS ב-Q-TOF-MS. לפיכך, יישום טכנולוגיית MSn לזיהוי מבני ב- TCM הוא חיוני.
הרפואה הטיבטית היא מרכיב משמעותי של TCM13, ותרופות אלה מופקות בעיקר מבעלי חיים, צמחים ומינרלים הנמצאים באזור הרמה14. התרופה הטיבטית Abelmoschus manihot seeds (AMS) היא זרע של Abelmoschus manihot (פשתן) רפואי. AMS היא צמחי מרפא מסורתיים המשמשים לטיפול במצבים כגון אטופיק דרמטיטיס, שיגרון וצרעת. הוא מכיל כלקון, בעל השפעות אנטיבקטריאליות, אנטי פטרייתיות, אנטי סרטניות, נוגדות חמצון ואנטי דלקתיות15. במחקר הנוכחי שופרו הליכי MS n, ופותחה שיטה מפורטת לזיהוי מבנים מורכבים ברפואה הטיבטית AMS באמצעות IT-MSו-MS n. פרמטרים מסוימים של MS, כולל מצב היונים, טווח הסריקה ומצב ההתנגשות, עברו אופטימיזציה כדי להתגבר על בעיות בזיהוי תרכובות עקבות. מחקר זה נועד לקדם את זיהוי המבנה הסטנדרטי של תרכובות קורט ב- TCM.
IT-MS וטכנולוגיית MSn שלה מציעות גישה חדשה לזיהוי המבנה של תרכובות TCM עקבות. בניגוד ל-Q-TOF-MS, שלא הצליח לזהות לעומק את יוני הפרגמנט, IT-MS עם טכנולוגיית MSn מצטיין ביכולתו לבודד ולצבור יונים. מאמר זה מתאר שיטה לזיהוי תרכובות קורט ברפואה הטיבטית באמצעות טכניקת IT-MS ו-MSn . השיטה משתמשת ב…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי תוכנית הכישרונות Xinglin של אוניברסיטת צ’נגדו של TCM (מס ‘030058191), קרן מדעי הטבע של סצ’ואן (2022NSFSC1470), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82204765).
Acetonitrile | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | LC-MS grade |
Formic Acid | Knowles | CAS 64-18-6 | HPLC grade |
Linear ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL | |
liquid chromatograph | Thermo Scientific | U3000 | |
LTQ Tune | Thermo Scientific | version 2.8.0 | MS control software |
Methanol | Thermo Scientific | CAS 67-56-1 | LC-MS grade |
Pure water | Thermo Scientific | CAS 7732-18-5 | LC-MS grade |
Xcalibur | Thermo Scientific | version 2.0 | LC-IT-MS operational software |