手動受粉、顕微鏡検査、および S遺伝子型分析を使用した柑橘類の自己(非)適合性および相互(非)適合性関係の決定
Summary
このプロトコルは、柑橘類の品種における花粉の適合性と非適合性を決定するための迅速な方法を提供します。
Abstract
柑橘類はS-RNaseベースの自己不適合を使用して自家花粉を拒絶するため、受粉と受精を成功させるには近くの花粉症の木が必要です。ただし、花粉症として機能するのに適した品種を特定することは、時間のかかるプロセスです。この問題を解決するために、我々は、アガロースゲル電気泳動とアニリンブルー染色を利用した受粉適合柑橘類品種を迅速に同定する方法を開発しました。花粉の適合性は、全DNAを抽出し、特異的プライマーを用いてPCRベースのジェノタイピングアッセイを行うことにより、 S 遺伝子型の同定に基づいて決定されます。さらに、手動受粉の3〜4日後にスタイルを収集し、アニリンブルー染色を行います。最後に、花粉管の成長状況を蛍光顕微鏡で観察する。花粉の適合性と非適合性は、花粉管の成長が正常であるか抑制されているかをそれぞれ観察することによって確立できます。この方法は、その単純さと費用対効果のために、異なる柑橘類品種の花粉適合性および非適合性を決定して、異なる品種間の非適合性グループおよび非適合性関係を確立するための効果的なツールである。この方法は、適切な花粉媒介者の木の選択を成功させるために不可欠な情報を提供し、したがって、新しい果樹園の設立と繁殖プログラムのための適切な親の選択を容易にします。
Introduction
自己不適合(SI)は、被子植物種の約40%に存在する遺伝的に制御されたメカニズムです。このプロセスでは、雌しべは同じSI遺伝子型を持つ植物からの花粉を拒絶し、したがって自家受精を防ぎます1,2。Ma jia pummeloは、中国の金蘇省の地元の品種で、大きくてピンク色の果実、豊富な果汁、甘酸っぱい味、厚い皮の優れた品質を備えています3。SIは交配を促進しますが、果物の収量と品質に悪影響を及ぼし4、信頼性の高い結実率と高収量のために、異なるSI遺伝子型を持つ適切な花粉症の木を必要とします。現在、SIには、アブラナ科に代表される胞子体自己不適合(SSI)と、バラ科、パパベラ科、ミカン科、ナス科に代表される配偶体自己不適合(GSI)の2つの主要なタイプがあります5,6,7,8。
柑橘類は世界で最も重要な果物作物の一つです。S-RNaseベースのGSIシステムは、多くの柑橘類のアクセッションに見られ、結実率に悪影響を及ぼします9。このシステムでは、SIは、雌しべS決定基と花粉S決定基7を運ぶ2つの複雑な対立遺伝子を持つ単一の多型遺伝子座であるS遺伝子座によって制御されます。雌の決定基はSリボヌクレアーゼ(S-RNase)であり、雄の決定基はS遺伝子座Fボックス(SLF)7です。雌しべの細胞はS-RNaseタンパク質を分泌します。非自己S-RNaseはSLFタンパク質によって認識され、26Sプロテアソーム経路による非自己S-RNaseのユビキチン化と分解につながります。対照的に、自己S-RNaseは、SLFタンパク質を回避し、したがってユビキチン化を妨げるため、花粉管(PT)の成長を蓄積して阻害することができます10,11,12,13。
本稿では、S遺伝子型や花粉の適合性・不適合度を特定するのに役立つin vivo技術について報告する。このプロトコルでは、葉から全DNAを抽出し、S特異的プライマーを使用してS遺伝子型を予測します。さらに、アニリンブルー染色とそれに続く手受粉による蛍光顕微鏡検査は、適合性と非適合性の程度の証拠を提供します。実験室での花の手動受粉を含む半生体内受粉手順14,15も、自己適合性および非適合性の程度を評価するために適応されています。しかし、私たちはまた、花粉管が自然条件で発達できるように、望ましくない花粉による汚染を避けるために、野外受粉とそれに続く花の袋詰めを使用しました。このプロトコルはシンプルでわかりやすく、適切な花粉症の木をうまく選択するために必要な情報を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
果物作物では、単為結果性とSIの両方が種なし果実への道を開くため、重要な形質です-消費者から高く評価されている形質です。自己不適合は自家花粉の拒絶を促進し、したがって近親交配を防ぎます20。柑橘類の中で、プメロは自己不適合品種です7。すべての被子植物種のほぼ40%がSI21を示します。この特性は結実を妨げ、収量を低下さ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、中国国家自然科学財団(32122075、32072523)によって財政的に支援されました。
Materials
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
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