Koncentration av viruspartiklar från miljövatten- och avloppsvattenprover med skummjölksflockning och ultrafiltrering
Summary
Viruskoncentration från miljövatten- och avloppsvattenprover är en utmanande uppgift, som främst utförs för identifiering och kvantifiering av virus. Medan flera viruskoncentrationsmetoder har utvecklats och testats demonstrerar vi här effektiviteten av ultrafiltrering och skummjölkflockning för RNA-virus med olika provtyper.
Abstract
Vatten- och avloppsbaserad epidemiologi har dykt upp som alternativa metoder för att övervaka och förutsäga utbrott i samhällen. Återvinning av mikrobiella fraktioner, inklusive virus, bakterier och mikroeukaryoter från avloppsvatten och miljövattenprover är ett av de utmanande stegen i dessa metoder. I denna studie fokuserade vi på återvinningseffektiviteten för sekventiell ultrafiltrering och skummjölkflockning (SMF) -metoder med pansar-RNA som ett testvirus, vilket också används som kontroll av vissa andra studier. Förfiltrering med 0,45 μm och 0,2 μm membranskivfilter applicerades för att eliminera fasta partiklar före ultrafiltrering för att förhindra igensättning av ultrafiltreringsanordningar. Testprover, bearbetade med sekventiell ultrafiltreringsmetod, centrifugerades med två olika hastigheter. En ökad hastighet resulterade i lägre återhämtnings- och positivitetshastigheter för pansar-RNA. Å andra sidan resulterade SMF i relativt konsekventa återhämtnings- och positivitetsnivåer för pansar-RNA. Ytterligare tester utförda med miljövattenprover visade användbarheten av SMF för att koncentrera andra mikrobiella fraktioner. Uppdelningen av virus i fasta partiklar kan påverka den totala återvinningsgraden, med tanke på det förfiltreringssteg som tillämpas före ultrafiltrering av avloppsvattenprover. SMF med förfiltrering presterade bättre när den applicerades på miljövattenprover på grund av lägre fasta koncentrationer i proverna och därmed lägre fördelningshastigheter till fasta ämnen. I den aktuella studien uppstod idén om att använda en sekventiell ultrafiltreringsmetod från nödvändigheten att minska den slutliga volymen av viruskoncentraten under COVID-19-pandemin, när tillgången på de vanliga ultrafiltreringsanordningarna var begränsad och det fanns ett behov av utveckling av alternativa virala koncentrationsmetoder.
Introduction
Att bestämma den effektiva koncentrationen av mikroorganismer i yt- och avloppsvattenprover för mikrobiell samhällsanalys och epidemiologiska studier är ett av de viktiga stegen för att övervaka och förutsäga utbrott i samhällen 1,2. COVID-19-pandemin utvecklade vikten av att förbättra koncentrationsmetoderna. COVID-19 uppstod i slutet av 2019 och utgör från och med mars 2023 fortfarande ett hot mot människors hälsa, det sociala livet och ekonomin. Effektiva övervaknings- och kontrollstrategier för att lindra effekterna av COVID-19-utbrott i samhällen har blivit ett viktigt forskningsämne, eftersom nya vågor och varianter av COVID-19 har dykt upp utöver den snabba överföringen och spridningen av viruset, liksom orapporterade och odiagnostiserade asymptomatiska fall 3,4,5. Användningen av avloppsvattenbaserad epidemiologi för COVID-19 av civilsamhällesorganisationer, myndigheter och offentliga eller privata verktyg har varit till hjälp för att tillhandahålla snabb utbrottsrelaterad information och mildra effekterna av COVID-19-utbrott 6,7,8,9. Koncentrationen av SARS-CoV-2, ett höljet RNA-virus, i avloppsvattenprover utgör dock fortfarande utmaningar10. Till exempel är en av dessa utmaningar uppdelningen av SARS-CoV-2 i fasta ämnen i avloppsvatten, vilket kan påverka återvinningen när de fasta ämnena elimineras under koncentration11. Om så är fallet bör kvantifiering/bedömning inriktas på både fasta och vattenhaltiga faser av miljövattenprover, snarare än enbart vattenfasen. Dessutom kan valet av koncentrationsmetod ändras på grundval av tester och analyser i senare led. Koncentrationen av viruspartiklar och patogener från miljöprover har blivit ett brådskande forskningsämne med utvecklingen inom sekvenserings- och mikrobiomfält.
Olika viruskoncentrationsmetoder har tillämpats inom viruskoncentration från miljövatten- och avloppsvattenprover. Några vanliga metoder är filtrering, skummjölksflockning (SMF), adsorption/eluering och polyetylenglykolutfällning12-17. Bland dem har SMF ansetts vara en billig och effektiv metod, framgångsrikt testad och tillämpad för att återställa virus, inklusive SARS-CoV-2, från avloppsvatten och ytvatten12,15,16,18. SMF-förfarandet är ett relativt nytt tillvägagångssätt som har fått ökat erkännande bland många miljöstudier som en lämplig metod för att samtidigt återvinna ett brett spektrum av mikroorganismer som virus, bakterier och protozoer från alla typer av vattenprover, nämligen slam, råavlopp, avloppsvatten och avloppsvattenprover19. Jämfört med andra kända metoder för att återvinna virus från miljöprover såsom ultrafiltrering och glycin-alkalisk eluering, frystorkningsbaserad metod eller ultracentrifugering och glycin-alkalisk eluering, har SMF rapporterats som den mest effektiva metoden med högre viral återhämtning och detektionsgrad18,20. I den aktuella studien använde vi Armored RNA som ett testvirus för att bedöma återhämtningseffektiviteten för viruskoncentrationsmetoder, inklusive tester för att bedöma SARS-CoV-2-återhämtning21,22.
Här testade vi avloppsvatten och miljövattenprover för att demonstrera användbarheten av SMF och en sekventiell ultrafiltreringsmetod för att koncentrera mikrobiella fraktioner för kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR), sekvensbaserad metagenomik och djupamplikonsekvensering. SMF är en relativt billigare metod och optimal för en större volym prover jämfört med ultrafiltreringsmetoder. Idén att använda en sekventiell ultrafiltreringsmetod uppstod från nödvändigheten att minska den slutliga volymen av viruskoncentraten under COVID-19-pandemin, när tillgången på de vanliga ultrafiltreringsanordningarna var begränsad och det fanns ett behov av utveckling av alternativa viruskoncentrationsmetoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett av de kritiska stegen i denna studie är eliminering av fasta partiklar genom att applicera ett förfiltreringssteg med 0,2 μm och 0,45 μm membranfilter. Med tanke på uppdelningen av virus i fasta partiklar, särskilt höljeförsedda virus, kan prefiltrering orsaka en signifikant förlust vid viral återhämtning30. Medan ett förfiltreringssteg för ultrafiltreringsmetoder nästan alltid är nödvändigt för miljö- och avloppsvattenprover för att förhindra att ultrafiltreringsanordning…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NSERC Alliance Covid-19 Grant (Award No. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan och Uyaguari-Díaz). MUD vill tacka University Research Grants Program (Award No. 325201). Både JF och JZA stöds av VADA-utbildningsprogrammet (Visual and Automated Disease Analytics). KY och JF fick båda stipendier från Mitacs Accelerate-programmet. MUD och hans laboratoriemedlemmar (KY, JF, JZA) stöds av NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) och Research Manitoba New Investigator Operating grant (No 5385). Särskilt tack till staden Winnipeg, Manitoba. Denna forskning genomfördes vid University of Manitoba. Vi vill erkänna att University of Manitoba campus ligger på de ursprungliga länderna Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota och Dene folk och på hemlandet Métis Nation.
Materials
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
References
- Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
- Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
- Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
- Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
- Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
- Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
- Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
- Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
- Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
- Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
- Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
- Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
- Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
- Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
- Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
- Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
- Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
- Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
- Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
- Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
- Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
- Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
- Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
- Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), 3526-3537 (2018).
- . Geneious Available from: https://www.geneious.com (2021)
- Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
- Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
- Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
- Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).
