Isolement de vésicules extracellulaires à faible teneur en endotoxines dérivées de lignées cellulaires cancéreuses
Summary
Le protocole proposé comprend des lignes directrices sur la façon d’éviter la contamination par l’endotoxine lors de l’isolement des vésicules extracellulaires à partir de surnageants de culture cellulaire, et sur la façon de les évaluer correctement.
Abstract
Les vésicules extracellulaires (VE) sont une population hétérogène de vésicules membranaires libérées par les cellules in vitro et in vivo. Leur omniprésence et leur rôle important en tant que porteurs d’informations biologiques en font des objets d’étude intrigants, nécessitant des protocoles fiables et répétitifs pour leur isolement. Cependant, il est difficile de réaliser leur plein potentiel car il existe encore de nombreux obstacles techniques liés à leur recherche (comme une acquisition appropriée). Cette étude présente un protocole pour l’isolement de petits VE (selon la nomenclature MISEV 2018) à partir du surnageant de culture de lignées cellulaires tumorales basé sur la centrifugation différentielle. Le protocole comprend des lignes directrices sur la façon d’éviter la contamination par des endotoxines pendant l’isolement des VE et sur la façon de les évaluer correctement. La contamination par les endotoxines des véhicules électriques peut entraver considérablement les expériences ultérieures ou même masquer leurs véritables effets biologiques. D’autre part, la présence négligée d’endotoxines peut conduire à des conclusions incorrectes. Ceci est particulièrement important lorsqu’il s’agit de cellules du système immunitaire, y compris les monocytes, car les monocytes constituent une population particulièrement sensible aux résidus d’endotoxines. Par conséquent, il est fortement recommandé de dépister la contamination par les endotoxines des VE, en particulier lorsque vous travaillez avec des cellules sensibles aux endotoxines telles que les monocytes, les macrophages, les cellules suppressives dérivées de myéloïdes ou les cellules dendritiques.
Introduction
Les vésicules extracellulaires (VE), selon la nomenclature MISEV 2018, sont un terme collectif décrivant divers sous-types de vésicules membraneuses sécrétées par des cellules qui jouent un rôle crucial dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques 1,2. De plus, les véhicules électriques sont prometteurs en tant que nouveaux biomarqueurs pour diverses maladies, ainsi qu’en tant qu’agents thérapeutiques et véhicules d’administration de médicaments. Cependant, la réalisation de leur plein potentiel est difficile car il existe encore de nombreux obstacles techniques liés à leur acquisition3. L’un de ces défis est l’isolement des véhicules électriques exempts d’endotoxines, qui a été négligé dans de nombreux cas. L’une des endotoxines les plus courantes est le lipopolysaccharide (LPS), qui est un composant majeur des parois cellulaires bactériennes à Gram négatif et peut provoquer une réponse inflammatoire aiguë, en raison de la libération d’un grand nombre de cytokines inflammatoires par diverses cellules 4,5. Le LPS induit une réponse en se liant à la protéine de liaison LPS, suivie d’une interaction avec le complexe CD14/TLR4/MD2 sur les cellules myéloïdes. Cette interaction conduit à l’activation des voies de signalisation dépendantes de MyD88 et TRIF, qui à son tour déclenche le facteur nucléaire kappa B (NFkB). La translocation de NFkB vers le noyau initie la production de cytokines6. Les monocytes et les macrophages sont très sensibles au LPS, et leur exposition au LPS entraîne la libération de cytokines et de chimiokines inflammatoires (p. ex. IL-6, IL-12, CXCL8 et TNF-α)7,8. La structure CD14 permet la liaison de différentes espèces de LPS ayant une affinité similaire et sert de corécepteur pour d’autres récepteurs de type Toll (TLR) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 et 9)6. Le nombre d’études menées sur les effets des VE sur les monocytes/macrophages continue d’augmenter 9,10,11. Surtout du point de vue de l’étude des fonctions des monocytes, de leurs sous-populations et d’autres cellules immunitaires, la présence d’endotoxines et même leur présence masquée dans les VE est d’une grande importance12. La contamination négligée des VE par des endotoxines peut conduire à des conclusions trompeuses et cacher leur véritable activité biologique. En d’autres termes, travailler avec des cellules monocytaires nécessite de faire confiance à l’absence de contamination par les endotoxines13. Les sources potentielles d’endotoxines peuvent être l’eau, les milieux et sérums obtenus commercialement, les composants et additifs de médias, la verrerie de laboratoire et la vaisselle en plastique 5,14,15.
Par conséquent, cette étude visait à développer un protocole pour l’isolement des VE à faible teneur en endotoxines. Le protocole fournit des conseils simples sur la façon d’éviter la contamination par les endotoxines pendant l’isolement des VE au lieu d’éliminer les endotoxines des VE. Auparavant, de nombreux protocoles ont été présentés sur la façon d’éliminer les endotoxines, par exemple des nanoparticules modifiées utilisées en nanomédecine; cependant, aucun d’entre eux n’est utile pour les structures biologiques telles que les véhicules électriques. La dépyrogénation efficace des nanoparticules peut être réalisée par rinçage à l’éthanol ou à l’acide acétique, chauffage à 175 °C pendant 3 h, irradiation γ ou traitement au triton X-100; cependant, ces procédures conduisent à la destruction des VE16,17.
Le protocole présenté est une étude pionnière axée sur l’évitement des impuretés endotoxines dans les VE, contrairement aux études précédentes sur l’effet des VE sur les monocytes9. L’application des principes proposés à la pratique de laboratoire peut aider à obtenir des résultats de recherche fiables, ce qui peut être crucial lors de l’examen de l’utilisation potentielle des VE comme agents thérapeutiques en clinique12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Au cours des dernières années, les méthodes d’isolation correcte des véhicules électriques sont devenues de plus en plus importantes, permettant leurs analyses plus fiables, par exemple dans le contexte de l’obtention de données omiques et fonctionnelles fiables24. Sur la base de l’expérience de recherche antérieure, il semble que non seulement le type de méthode d’isolement, mais aussi d’autres conditions au cours de cette procédure peuvent être importants. L’utilisation de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Centre national des sciences, Pologne, numéro de subvention 2019/33/B/NZ5/00647. Nous tenons à remercier le professeur Tomasz Gosiewski et Agnieszka Krawczyk du département de microbiologie médicale moléculaire du Collège médical de l’Université Jagellonne pour leur aide inestimable dans la détection de l’ADN bactérien dans les véhicules électriques.
Materials
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
- Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
- Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
- Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
- Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
- Schwarz, H., et al. Biological activity of masked endotoxin. Scientific Reports. 7, 44750 (2017).
- Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
- Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
- Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
- Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics – an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
- Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
- Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
- Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
- Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs – How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
- Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
- Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
- Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
- Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
- Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when ‘exosome-depleted serum’ is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
- Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
- Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
- Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
