Isolering av ekstracellulære vesikler med lavt endotoksininnhold avledet fra kreftcellelinjer
Summary
Den foreslåtte protokollen inneholder retningslinjer for hvordan man kan unngå forurensning med endotoksin under isolering av ekstracellulære vesikler fra cellekultursupernatanter, og hvordan man skal evaluere dem riktig.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV) er en heterogen populasjon av membranvesikler frigjort av celler in vitro og in vivo. Deres allestedsnærvær og betydelige rolle som bærere av biologisk informasjon gjør dem til spennende studieobjekter, og krever pålitelige og repeterende protokoller for deres isolasjon. Det er imidlertid vanskelig å realisere sitt fulle potensiale, da det fortsatt er mange tekniske hindringer knyttet til deres forskning (som riktig oppkjøp). Denne studien presenterer en protokoll for isolering av små EV (i henhold til MISEV 2018-nomenklaturen) fra kultursupernatanten av tumorcellelinjer basert på differensialsentrifugering. Protokollen inneholder retningslinjer for hvordan man kan unngå forurensning med endotoksiner under isolering av elbiler og hvordan man skal evaluere dem riktig. Endotoksinforurensning av elbiler kan betydelig hindre påfølgende eksperimenter eller til og med maskere deres sanne biologiske effekter. På den annen side kan den oversette tilstedeværelsen av endotoksiner føre til feil konklusjoner. Dette er spesielt viktig når det refereres til celler i immunsystemet, inkludert monocytter, fordi monocytter utgjør en populasjon som er spesielt følsom for endotoksinrester. Derfor anbefales det sterkt å screene EV for endotoksinforurensning, spesielt når du arbeider med endotoksinfølsomme celler som monocytter, makrofager, myeloidederiverte suppressorceller eller dendrittiske celler.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (EV), ifølge MISEV 2018-nomenklaturen, er et samlebegrep som beskriver ulike subtyper av celleutskillede membranøse vesikler som spiller avgjørende roller i mange fysiologiske og patologiske prosesser 1,2. Videre viser EV løfte som nye biomarkører for ulike sykdommer, samt terapeutiske midler og legemiddelleveringsbiler. Det er imidlertid vanskelig å realisere sitt fulle potensiale, da det fortsatt er mange tekniske hindringer knyttet til oppkjøpet3. En slik utfordring er isoleringen av endotoksinfrie elbiler, som har blitt neglisjert i mange tilfeller. En av de vanligste endotoksinene er lipopolysakkarid (LPS), som er en viktig komponent i gramnegative bakterielle cellevegger og kan forårsake en akutt inflammatorisk respons på grunn av frigjøring av et stort antall inflammatoriske cytokiner av forskjellige celler 4,5. LPS induserer en respons ved binding til LPS-bindende protein, etterfulgt av interaksjon med CD14/TLR4/MD2-komplekset på myeloide celler. Denne interaksjonen fører til aktivering av MyD88- og TRIF-avhengige signalveier, som igjen utløser nukleærfaktoren kappa B (NFkB). Translokasjon av NFkB til kjernen initierer produksjonen av cytokiner6. Monocytter og makrofager er svært følsomme for LPS, og deres eksponering for LPS resulterer i frigjøring av inflammatoriske cytokiner og kjemokiner (f.eks. IL-6, IL-12, CXCL8 og TNF-α) 7,8. CD14-strukturen muliggjør binding av forskjellige LPS-arter med lignende affinitet og fungerer som en co-reseptor for andre toll-lignende reseptorer (TLR) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 og 9) 6. Antall studier som utføres på effekten av elbiler på monocytter/makrofager øker fortsattmed 9,10,11. Spesielt fra perspektivet om å studere funksjonene til monocytter, deres underpopulasjoner og andre immunceller, er tilstedeværelsen av endotoksin og til og med deres maskerte tilstedeværelse i EV av stor betydning12. Den oversette forurensningen av elbiler med endotoksiner kan føre til misvisende konklusjoner og skjule deres sanne biologiske aktivitet. Med andre ord, arbeid med monocytiske celler krever tillit i fravær av endotoksinforurensning13. Potensielle kilder til endotoksiner kan være vann, kommersielt oppnådde medier og sera, mediekomponenter og tilsetningsstoffer, laboratorieglass og plastvarer 5,14,15.
Derfor hadde denne studien som mål å utvikle en protokoll for isolering av lavendotoksinholdige EVer. Protokollen gir enkle tips om hvordan man kan unngå endotoksinsmitte under isolasjon av elbiler i stedet for å fjerne endotoksiner fra elbiler. Tidligere har mange protokoller blitt presentert for hvordan man fjerner endotoksiner fra for eksempel konstruerte nanopartikler som brukes i nanomedisin; Ingen av dem er imidlertid nyttige for biologiske strukturer som elbiler. Den effektive depyrogeneringen av nanopartikler kan utføres ved etanol eller eddiksyre skylling, oppvarming ved 175 ° C i 3 timer, γ bestråling eller triton X-100 behandling; Disse prosedyrene fører imidlertid til ødeleggelse av elbiler16,17.
Den presenterte protokollen er en banebrytende studie fokusert på å unngå endotoksin urenheter i EV, i motsetning til tidligere studier på effekten av EV på monocytter9. Bruk av foreslåtte prinsipper i laboratoriepraksis kan bidra til å oppnå pålitelige forskningsresultater, noe som kan være avgjørende når man vurderer potensiell bruk av elbiler som terapeutiske midler i klinikken12.
Protocol
Representative Results
Discussion
I løpet av de siste årene har metoder for riktig isolering av elbiler blitt stadig viktigere, noe som muliggjør ytterligere pålitelige analyser, for eksempel i sammenheng med å skaffe pålitelig omikk og funksjonelle data24. Basert på tidligere forskningserfaring ser det ut til at ikke bare typen isolasjonsmetode, men også andre forhold under denne prosedyren kan være viktige. Bruken av EV-utarmet FBS er allment anerkjent som en nødvendighet25,26<sup cla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Science Centre, Polen, stipendnummer 2019/33/B/NZ5/00647. Vi vil gjerne takke professor Tomasz Gosiewski og Agnieszka Krawczyk fra Institutt for molekylær medisinsk mikrobiologi, Jagiellonian University Medical College for deres uvurderlige hjelp i påvisning av bakterielt DNA i elbiler.
Materials
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
- Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
- Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
- Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
- Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
- Schwarz, H., et al. Biological activity of masked endotoxin. Scientific Reports. 7, 44750 (2017).
- Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
- Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
- Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
- Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics – an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
- Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
- Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
- Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
- Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs – How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
- Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
- Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
- Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
- Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
- Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when ‘exosome-depleted serum’ is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
- Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
- Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
- Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
