BS3 Chemische crosslinking assay: evaluatie van het effect van chronische stress op het celoppervlak GABAA receptorpresentatie in het knaagdierbrein
Summary
De BS3 chemische crosslinking assay onthult verminderde celoppervlak GABAA receptor expressie in muizenhersenen onder chronische psychosociale stressomstandigheden.
Abstract
Angst is een toestand van emotie die variabel het gedrag van dieren beïnvloedt, inclusief cognitieve functies. Gedragsmatige tekenen van angst worden waargenomen in het dierenrijk en kunnen worden herkend als adaptieve of onaangepaste reacties op een breed scala aan stressmodaliteiten. Knaagdieren bieden een bewezen experimenteel model voor translationele studies die de integratieve mechanismen van angst op moleculair, cellulair en circuitniveau aanpakken. In het bijzonder lokt het chronische psychosociale stressparadigma onaangepaste reacties uit die angst- / depressieve gedragsfenotypen nabootsen die analoog zijn tussen mensen en knaagdieren. Hoewel eerdere studies significante effecten van chronische stress op neurotransmitterinhoud in de hersenen laten zien, is het effect van stress op neurotransmitterreceptorniveaus onderbelicht. In dit artikel presenteren we een experimentele methode om de neuronale oppervlakteniveaus van neurotransmitterreceptoren bij muizen onder chronische stress te kwantificeren, met name gericht op gamma-aminoboterzuur (GABA) receptoren, die betrokken zijn bij de regulatie van emotie en cognitie. Met behulp van de membraan-ondoordringbare onomkeerbare chemische crosslinker, bissulfosuccinimidylsuberaat (BS3), tonen we aan dat chronische stress de oppervlaktebeschikbaarheid van GABA A-receptoren in de prefrontale cortex aanzienlijk downreguleert. De neuronale oppervlakteniveaus van GABAA-receptoren zijn het snelheidsbeperkende proces voor GABA-neurotransmissie en kunnen daarom worden gebruikt als een moleculaire marker of een proxy van de mate van angst – / depressieve fenotypen in experimentele diermodellen. Deze crosslinking-benadering is van toepassing op een verscheidenheid aan receptorsystemen voor neurotransmitters of neuromodulatoren die tot expressie komen in elk hersengebied en zal naar verwachting bijdragen aan een dieper begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan emotie en cognitie.
Introduction
Neurotransmitterreceptoren zijn gelokaliseerd aan het neuronale plasmamembraanoppervlak of intracellulair op de endomembranen (bijv. Het endosoom, het endoplasmatisch reticulum [ER] of het trans-Golgi-apparaat) en pendelen dynamisch tussen deze twee compartimenten, afhankelijk van intrinsieke fysiologische toestanden in neuronen of als reactie op extrinsieke neurale netwerkactiviteiten 1,2. Aangezien nieuw uitgescheiden neurotransmitters hun fysiologische functies voornamelijk opwekken via de oppervlakte-gelokaliseerde pool van receptoren, zijn de oppervlaktereceptorniveaus voor een bepaalde neurotransmitter een van de kritische determinanten van zijn signaleringscapaciteit binnen het neurale circuit3.
Er zijn verschillende methoden beschikbaar om oppervlaktereceptorniveaus in gekweekte neuronen te controleren, waaronder de oppervlaktebiotinyleringstest4, de immunofluorescentietest met een specifiek antilichaam in niet-permeabiliseerde omstandigheden5, of het gebruik van een receptortransgen dat genetisch is gefuseerd met een pH-gevoelige fluorescerende optische indicator (bijv. pHluorine)6. Daarentegen zijn deze benaderingen beperkt of onpraktisch bij het beoordelen van oppervlaktereceptorniveaus in vivo. De oppervlaktebiotinyleringsprocedure is bijvoorbeeld mogelijk niet praktisch voor het verwerken van grote hoeveelheden en monsteraantallen in vivo hersenweefsels vanwege de relatief hoge prijs en de daaropvolgende stappen die nodig zijn voor het zuiveren van de gebiotinyleerde eiwitten op avidine-geconjugeerde kralen. Voor neuronen die zijn ingebed in driedimensionale hersenarchitectuur, kunnen lage toegankelijkheid van antilichamen of problemen bij op microscoop gebaseerde kwantificering een significante beperking vormen voor het beoordelen van de oppervlaktereceptorniveaus in vivo. Om de verdeling van neurotransmitterreceptoren in intacte hersenen te visualiseren, kunnen niet-invasieve methoden, zoals positronemissietomografie, worden gebruikt om de receptorbezetting te meten en de oppervlaktereceptorniveauste schatten 7. Deze aanpak is echter kritisch afhankelijk van de beschikbaarheid van specifieke radioliganden, dure apparatuur en speciale expertise, waardoor deze minder toegankelijk is voor routinematig gebruik door de meeste onderzoekers.
Hier beschrijven we een eenvoudige, veelzijdige methode voor het meten van oppervlaktereceptorniveaus in experimentele dierlijke hersenen ex vivo met behulp van een in water oplosbare, membraan-ondoordringbare chemische crosslinker, bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3) 8,9. BS3 richt zich op primaire amines in de zijketen van lysineresiduen en kan covalent eiwitten in de nabijheid van elkaar kruisen. Wanneer hersenplakken vers worden bereid uit een gebied van belang en geïncubeerd in een buffer die BS3 bevat, worden de celoppervlakreceptoren gekruist met naburige eiwitten en transformeren ze dus in soorten met een hoger molecuulgewicht, terwijl de intracellulaire endomembrane-geassocieerde receptoren ongewijzigd blijven. Daarom kunnen de oppervlakte- en intracellulaire receptorpools worden gescheiden door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en gekwantificeerd door western blot met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor de te bestuderen receptor.
Onvoorspelbare chronische milde stress (UCMS) is een beproefd experimenteel paradigma voor het induceren van chronische psychosociale stress bij knaagdieren10. UCMS lokt angst-/depressief-achtige gedragsfenotypes en cognitieve tekorten uit via de modulatie van een reeks neurotransmittersystemen, waaronder GABA en zijn receptoren10,11. In het bijzonder is de α5 subunit-bevattende GABA A-receptor (α5-GABAA R) betrokken bij de regulatie van geheugen en cognitieve functies12,13, wat wijst op de mogelijke betrokkenheid van veranderde functies van deze subeenheid bij UCMS-geïnduceerde cognitieve tekorten. In dit protocol gebruikten we de BS3 crosslinking assay om niveaus van oppervlakte-uitgedrukte α5-GABAAR in de prefrontale cortex van muizen blootgesteld aan UCMS te kwantificeren in vergelijking met niet-gestreste controlemuizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel de impact van chronische psychosociale stress op gedrag (d.w.z. emotionaliteit en cognitieve tekorten) en moleculaire veranderingen (d.w.z. verminderde expressie van GABAerge genen en bijbehorende tekorten in GABAerge neurotransmissie) goed gedocumenteerd zijn10, moeten de mechanismen die ten grondslag liggen aan dergelijke tekorten verder worden onderzocht. In het bijzonder, gezien de recente studie die aantoont dat chronische stress het neuronale proteoom aanzienlijk beïnvloedt door over…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken het personeel van de CAMH-dierenfaciliteit voor de zorg voor de dieren gedurende de studieduur. Dit werk werd ondersteund door het Canadian Institute of Health Research (CIHR Project Grant # 470458 to T.T.), het Discovery Fund van de CAMH (naar T.P.), de National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD award #25637 to E.S.), en het Campbell Family Mental Health Research Institute (to E.S.). E.S. is de oprichter van Damona Pharmaceuticals, een biofarmaceutisch bedrijf dat zich toelegt op het brengen van nieuwe GABAerge verbindingen naar de kliniek.
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors – Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors – Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
- Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
- Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
- Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
- Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
- Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , 1-19 (2012).
- Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
- Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
- Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
- Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
- Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208 (2021).
- Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E. Molecular origin of somatostatin-positive neuron vulnerability. Molecular Psychiatry. 27 (4), 2304-2314 (2022).
- Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
- Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
- Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
- Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358 (2016).
- Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
- Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195 (2015).
