BS3 Chemical Crosslinking Assay: valutazione dell'effetto dello stress cronico sulla superficie cellulare Presentazione del recettore GABAA nel cervello dei roditori
Summary
Il test di reticolazione chimica BS3 rivela una ridotta espressionedel recettore GABA A della superficie cellulare nel cervello dei topi in condizioni di stress psicosociale cronico.
Abstract
L’ansia è uno stato di emozione che influenza in modo variabile i comportamenti degli animali, comprese le funzioni cognitive. I segni comportamentali di ansia sono osservati in tutto il regno animale e possono essere riconosciuti come risposte adattive o disadattive a una vasta gamma di modalità di stress. I roditori forniscono un modello sperimentale collaudato per gli studi traslazionali che affrontano i meccanismi integrativi dell’ansia a livello molecolare, cellulare e circuitale. In particolare, il paradigma dello stress psicosociale cronico suscita risposte disadattive che imitano fenotipi comportamentali ansiosi / depressivi che sono analoghi tra esseri umani e roditori. Mentre studi precedenti mostrano effetti significativi dello stress cronico sul contenuto dei neurotrasmettitori nel cervello, l’effetto dello stress sui livelli del recettore dei neurotrasmettitori è poco studiato. In questo articolo, presentiamo un metodo sperimentale per quantificare i livelli di superficie neuronale dei recettori dei neurotrasmettitori nei topi sottoposti a stress cronico, concentrandoci in particolare sui recettori dell’acido gamma-aminobutirrico (GABA), che sono implicati nella regolazione delle emozioni e della cognizione. Utilizzando il reticolante chimico irreversibile impermeabile alla membrana, bissulfosuccinimidil suberato (BS3), dimostriamo che lo stress cronico riduce significativamente la disponibilità superficiale dei recettori GABAA nella corteccia prefrontale. I livelli di superficie neuronale dei recettori GABAA sono il processo limitante per la neurotrasmissione GABA e potrebbero, quindi, essere utilizzati come marcatore molecolare o proxy del grado di fenotipi ansiosi / depressivi in modelli animali sperimentali. Questo approccio di crosslinking è applicabile a una varietà di sistemi recettoriali per neurotrasmettitori o neuromodulatori espressi in qualsiasi regione del cervello e ci si aspetta che contribuisca a una comprensione più profonda dei meccanismi alla base delle emozioni e della cognizione.
Introduction
I recettori dei neurotrasmettitori sono localizzati sulla superficie della membrana plasmatica neuronale o intracellulare sulle endomembrane (ad esempio, l’endosoma, il reticolo endoplasmatico [ER], o l’apparato trans-Golgi) e fanno la spola dinamica tra questi due compartimenti a seconda degli stati fisiologici intrinseci nei neuroni o in risposta alle attività estrinseche della rete neurale 1,2. Poiché i neurotrasmettitori appena secreti suscitano le loro funzioni fisiologiche principalmente attraverso il pool di recettori localizzato in superficie, i livelli di recettori di superficie per un dato neurotrasmettitore sono uno dei determinanti critici della sua capacità di segnalazione all’interno del circuito neurale3.
Sono disponibili diversi metodi per monitorare i livelli dei recettori di superficie nei neuroni in coltura, tra cui il saggio di biotinilazione superficiale4, il saggio di immunofluorescenza con un anticorpo specifico in condizioni non permeabilizzate5 o l’uso di un transgene recettore geneticamente fuso con un indicatore ottico fluorescente sensibile al pH (ad esempio, pHluorin)6. Al contrario, questi approcci sono limitati o poco pratici quando si valutano i livelli dei recettori di superficie in vivo. Ad esempio, la procedura di biotinilazione superficiale potrebbe non essere pratica per il trattamento di grandi quantità e numeri di campioni di tessuti cerebrali in vivo a causa del suo prezzo relativamente elevato e delle successive fasi necessarie per purificare le proteine biotinilate su perle coniugate con avidina. Per i neuroni incorporati nell’architettura cerebrale tridimensionale, la bassa accessibilità agli anticorpi o le difficoltà nella quantificazione basata sul microscopio possono rappresentare una limitazione significativa per valutare i livelli dei recettori di superficie in vivo. Per visualizzare la distribuzione dei recettori dei neurotrasmettitori nel cervello intatto, metodi non invasivi, come la tomografia ad emissione di positroni, potrebbero essere utilizzati per misurare l’occupazione dei recettori e stimarei livelli 7 del recettore di superficie. Tuttavia, questo approccio si basa in modo critico sulla disponibilità di leganti radio specifici, apparecchiature costose e competenze speciali, rendendolo meno accessibile per l’uso di routine da parte della maggior parte dei ricercatori.
Qui, descriviamo un metodo semplice e versatile per misurare i livelli di recettori di superficie in cervelli animali sperimentali ex vivo utilizzando un reticolante chimico solubile in acqua e impermeabile alla membrana, bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3)8,9. BS3 prende di mira le ammine primarie nella catena laterale dei residui di lisina e può reticolare covalentemente le proteine in prossimità l’una dell’altra. Quando le fette di cervello sono appena preparate da una regione di interesse e incubate in un tampone contenente BS3, i recettori della superficie cellulare sono reticolati con le proteine vicine e, quindi, si trasformano in specie ad alto peso molecolare, mentre i recettori associati all’endomembrana intracellulare rimangono invariati. Pertanto, i pool di recettori di superficie e intracellulari possono essere separati mediante elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e quantificati mediante western blot utilizzando anticorpi specifici per il recettore da studiare.
Lo stress cronico lieve imprevedibile (UCMS) è un paradigma sperimentale ben consolidato per indurre stress psicosociale cronico nei roditori10. UCMS suscita fenotipi comportamentali ansiosi / depressivi e deficit cognitivi attraverso la modulazione di una serie di sistemi di neurotrasmettitori, tra cui GABA e i suoi recettori10,11. In particolare, il recettore GABA A contenente subunità α5 (α5-GABAAR) è implicato nella regolazione della memoria e delle funzioni cognitive12,13, suggerendo il possibile coinvolgimento di funzioni alterate di questa subunità nei deficit cognitivi indotti da UCMS. In questo protocollo, abbiamo utilizzato il test di crosslinking BS3 per quantificare i livelli di α5-GABAAR espressi in superficie nella corteccia prefrontale dei topi esposti a UCMS rispetto ai topi di controllo non stressati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebbene l’impatto dello stress psicosociale cronico sui comportamenti (cioè emotività e deficit cognitivi) e sui cambiamenti molecolari (cioè ridotta espressione dei geni GABAergici e deficit di accompagnamento nella neurotrasmissione GABAergica) siano ben documentati10, i meccanismi alla base di tali deficit necessitano di ulteriori indagini. In particolare, dato il recente studio che dimostra che lo stress cronico influenza significativamente il proteoma neuronale attraverso il sovraccarico s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il personale della struttura per animali CAMH per essersi preso cura degli animali per tutta la durata dello studio. Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institute of Health Research (CIHR Project Grant #470458 to T.T.), dal Discovery Fund del CAMH (a T.P.), dalla National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (premio NARSAD #25637 a E.S.) e dal Campbell Family Mental Health Research Institute (a E.S.). E.S. è il fondatore di Damona Pharmaceuticals, una biofarmaceutica dedicata a portare nuovi composti GABAergici alla clinica.
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors – Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors – Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
- Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
- Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
- Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
- Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
- Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , 1-19 (2012).
- Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
- Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
- Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
- Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
- Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208 (2021).
- Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E. Molecular origin of somatostatin-positive neuron vulnerability. Molecular Psychiatry. 27 (4), 2304-2314 (2022).
- Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
- Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
- Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
- Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358 (2016).
- Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
- Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195 (2015).
