Isolatie en karakterisering van de muriene uterosacrale ligamenten en bekkenbodemorganen
Summary
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het ontleden van baarmoederosacrale ligamenten en andere bekkenbodemweefsels, waaronder de baarmoederhals, het rectum en de blaas bij muizen, om de studie van vrouwelijke voortplantingsweefsels uit te breiden.
Abstract
Bekkenorgaanverzakking (POP) is een aandoening die de integriteit, structuur en mechanische ondersteuning van de bekkenbodem beïnvloedt. De organen in de bekkenbodem worden ondersteund door verschillende anatomische structuren, waaronder spieren, ligamenten en bekken fascia. Het uterosacrale ligament (USL) is een kritische dragende structuur en letsel aan de USL resulteert in een hoger risico op het ontwikkelen van POP. Het huidige protocol beschrijft de dissectie van murine USL’s en de bekkenbodemorganen naast de verwerving van unieke gegevens over de biochemische samenstelling en functie van de USL met behulp van Raman-spectroscopie en de evaluatie van mechanisch gedrag. Muizen zijn een waardevol model voor preklinisch onderzoek, maar het ontleden van de murine USL is een moeilijk en ingewikkeld proces. Deze procedure presenteert een aanpak om de dissectie van muizenbekkenbodemweefsels, inclusief de USL, te begeleiden om meerdere beoordelingen en karakterisering mogelijk te maken. Dit werk is gericht op het helpen bij de dissectie van bekkenbodemweefsels door basiswetenschappers en ingenieurs, waardoor de toegankelijkheid van onderzoek naar de USL en bekkenbodemaandoeningen en de preklinische studie van de gezondheid van vrouwen met behulp van muismodellen wordt uitgebreid.
Introduction
Ongeveer 50% van de vrouwen heeft last van bekkenorgaanprolaps (POP)1,2. Ongeveer 11% van deze vrouwen voldoet aan de criteria voor het ondergaan van chirurgische reparatie, wat een slecht slagingspercentage heeft (~ 30%)3,4. POP wordt gekenmerkt door de afdaling van een of alle bekkenorganen (d.w.z. blaas, baarmoeder, baarmoederhals en rectum) uit hun natuurlijke positie als gevolg van het falen van de USL en de bekkenbodemspieren om voldoende ondersteuning te bieden5. Deze aandoening omvat anatomische disfunctie en verstoring van het bindweefsel, evenals neuromusculair letsel, naast predisponerende factoren 3,6. POP wordt geassocieerd met meerdere factoren zoals leeftijd, gewicht, pariteit en bevallingstype (d.w.z. vaginale of keizersneden). Van deze factoren wordt gedacht dat ze de mechanische integriteit van alle bekkenbodemweefsels beïnvloeden, waarbij zwangerschap en pariteit worden beschouwd als de belangrijkste oorzaken van POP 5,7,8.
De uterosacrale ligamenten (USL’s) zijn belangrijke ondersteunende structuren voor de baarmoeder, baarmoederhals en vagina en binden de baarmoederhals aan het heiligbeen4. Schade aan de USL’s brengt vrouwen een verhoogd risico op het ontwikkelen van POP. Er wordt aangenomen dat zwangerschap en bevalling extra druk leggen op de USL, wat mogelijk letsel veroorzaakt en de kans op POP verhoogt. De USL is een complex weefsel dat bestaat uit gladde spiercellen, bloedvaten en lymfevaten die heterogeen langs het ligament zijn verdeeld, die kunnen worden onderverdeeld in drie verschillende secties: cervicale, intermediaire en sacrale regio9. De mechanische integriteit van de USL is afgeleid van extracellulaire matrix (ECM) componenten zoals collageen, elastine en proteoglycanen 5,9,10. Van type I collageenvezels is bekend dat ze een belangrijke dragende trekcomponent van ligamenteuze weefsels zijn en daarom waarschijnlijk betrokken zijn bij USL-falen en POP11.
Er is een gebrek aan kennis over de oorzaken, prevalentie en effecten van POP bij vrouwen. De ontwikkeling van een geschikt diermodel van POP is noodzakelijk om ons begrip van de vrouwelijke bekkenbodem te bevorderen. Muizen en mensen hebben vergelijkbare anatomische oriëntatiepunten in het bekken, zoals de urineleiders, het rectum, de blaas, de eierstokken en ronde ligamenten9, evenals vergelijkbare snijpunten van de USL met de baarmoeder, baarmoederhals en heiligbeen. Verder bieden muizen het gemak van genetische manipulatie en hebben ze het potentieel om een gemakkelijk toegankelijk, kosteneffectief model te zijn voor de studie van POP9.
Deze studie ontwikkelde een methode om toegang te krijgen tot de USL en de verschillende bekkenbodemweefsels van nullipare (d.w.z. nooit zwangere) muizen. De geëxtraheerde USL’s werden onderworpen aan enzymatische vertering (d.w.z. om collageen en glycosaminoglycanen te verwijderen), getest om de mechanische respons onder trekbelasting te bepalen en geëvalueerd op biochemische samenstelling in een proof-of-concept-studie. Het vermogen om intacte weefsels te isoleren zal verdere mechanische en biochemische karakteriseringen van de bekkenbodemcomponenten vergemakkelijken, wat een cruciale eerste stap is naar het verbeteren van ons begrip van de letselrisico’s met betrekking tot bevalling, zwangerschap en POP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het effect van structurele schade op vrouwelijke voortplantingsweefsels is onderbelicht en een gemakkelijk toegankelijk diermodel voor POP-onderzoek is nodig. De muis is een kosteneffectief model dat menselijke voortplantingsstudies kan nabootsen16. Vanwege de groeiende belangstelling voor de studie van het vrouwelijke voortplantingssysteem, is er behoefte aan methoden die de studie van deze weefsels ondersteunen. Om aan deze behoefte te voldoen, wordt in dit werk een methode vastgesteld om muizen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de CU Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) -beurs (C.B.), de NSF Graduate Research Fellowship (LS), de Schmidt Science Fellowship (C.L.), het University of Colorado Research &; Innovation Seed Grant Program (2020-prijs aan V.F., S.C. en K.C.), en de Anschutz Boulder Nexus Seed Grant aan de Universiteit van Colorado (aan V.F. en K.C.). Speciale dank gaat uit naar Dr. Tyler Tuttle voor hulp bij het ontwerp van de laadkamer en de leden van het Calve-lab voor nuttige discussies.
Materials
| 11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
| Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
| Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
| FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
| FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
| Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
| Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
| Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
| T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
| Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
| Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |
References
- Maldonado, P. A., Wai, C. Y. Pelvic organ prolapse. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 43 (1), 15-26 (2016).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice: Pregnancy-induced changes in elastic fiber homeostasis in mouse vagina. American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Barber, M. D., Maher, C. Epidemiology and outcome assessment of pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 24 (11), 1783-1790 (2013).
- Becker, W. R., De Vita, R. Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).
- Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions. Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).
- Amundsen, C. L., Flynn, B. J., Webster, G. D. Anatomical correction of vaginal vault prolapse by uterosacral ligament fixation in women who also require a pubovaginal sling. Journal of Urology. 169 (5), 1770-1774 (2003).
- Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D. Pelvic organ prolapse. The Lancet. 396 (9566), 1027-1038 (2007).
- Blomquist, J. L., Muñoz, A., Carroll, M., Handa, V. L. Association of delivery mode with pelvic floor disorders after childbirth. Journal of the American Medical Association. 320 (23), 2438-2447 (2018).
- Iwanaga, R., et al. Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments. International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Evaluation of extracellular matrix protein expression and apoptosis in the uterosacral ligaments of patients with or without pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal. 32 (8), 2273-2281 (2021).
- Jimenez, J. M., et al. Multiscale mechanical characterization and computational modeling of fibrin gels. bioRxiv. , (2022).
- Fischenich, K. M., et al. Human articular cartilage is orthotropic where microstructure, micromechanics, and chemistry vary with depth and split-line orientation. Osteoarthritis and Cartilage. 28 (10), 1362-1372 (2020).
- Luetkemeyer, C. M., Neu, C. P., Calve, S. A method for defining tissue injury criteria reveals ligament deformation thresholds are multimodal. bioRxiv. , (2023).
- O’Brien, C. M., et al. In vivo Raman spectroscopy for biochemical monitoring of the human cervix throughout pregnancy. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 218 (5), 1-18 (2018).
- Louwagie, E. M., et al. et al. ultrasonic dimensions and parametric solid models of the gravid uterus and cervix. PLoS One. 16 (1), 0242118 (2021).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice. The American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Rahn, D. D., Ruff, M. D., Brown, S. A., Tibbals, H. F., Word, R. A. Biomechanical properties of the vaginal wall: Effect of pregnancy, elastic fiber deficiency, and pelvic organ prolapse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 198 (5), 1-6 (2008).
- Roman, S., et al. Evaluating alternative materials for the treatment of stress urinary incontinence and pelvic organ prolapse: A comparison of the in vivo response to meshes implanted in rabbits. Journal of Urology. 196 (1), 261-269 (2016).
- Couri, B. M., Lenis, A. T., Borazjani, A., Paraiso, M. F., Damaser, M. S. Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned. Expert Review of Obstetrics & Gynecology. 7 (3), 49 (2012).
- Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review. European Journal of Obstetrics & Gynecologyand Reproductive Biology. 144, S146-S158 (2009).
- Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex. Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).
- Tan, T., et al. Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).
- Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical analysis of the uterosacral ligament: Swine vs. human. Annals of Biomedical Engineering. 46 (12), 2036-2047 (2018).
- Vardy, M. D., et al. The effects of hormone replacement on the biomechanical properties of the uterosacral and round ligaments in the monkey model. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (5), 1741-1751 (2005).
- Shahryarinejad, A., Vardy, M. D. Comparison of human to macaque uterosacral-cardinal ligament complex and its relationship to pelvic organ prolapse. Toxicological Pathology. 36 (7), 101 (2008).
- Smith, T. M., Luo, J., Hsu, Y., Ashton-Miller, J., DeLancey, O. L. A novel technique to measure in vivo uterine suspensory ligament stiffness. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 209 (5), 1-7 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models for human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
