Dette arbeidet beskriver en protokoll for kvantifisering av globale histonmodifikasjoner ved bruk av intranukleær flowcytometri i isolert hjernemikroglia. Verket inneholder også mikrogliaisolasjonsprotokollen som ble brukt til datainnsamling.
Genekspresjonskontroll skjer delvis ved modifikasjoner i kromatinstrukturen, inkludert tillegg og fjerning av posttranslasjonelle modifikasjoner av histonhaler. Histon posttranslasjonelle modifikasjoner (HPTM) kan enten lette genuttrykk eller undertrykkelse. For eksempel nøytraliserer acetylering av histonhalelysinrester den positive ladningen og reduserer interaksjoner mellom halen og negativt ladet DNA. Reduksjonen i histonhale-DNA-interaksjoner resulterer i økt tilgjengelighet av det underliggende DNA, noe som muliggjør økt transkripsjonsfaktortilgang. Acetyleringsmerket fungerer også som et anerkjennelsessted for bromdomeneholdige transkripsjonsaktivatorer, noe som sammen resulterer i forbedret genuttrykk. Histonmerker kan reguleres dynamisk under celledifferensiering og som respons på forskjellige cellulære miljøer og stimuli. Mens neste generasjons sekvenseringsmetoder har begynt å karakterisere genomiske steder for individuelle histonmodifikasjoner, kan bare en modifikasjon undersøkes samtidig. Gitt at det er hundrevis av forskjellige HPTM-er, har vi utviklet et kvantitativt mål med høy gjennomstrømning av globale HPTM-er som kan brukes til å skjerme histonmodifikasjoner før vi utfører mer omfattende genomsekvenseringsmetoder. Denne protokollen beskriver en flowcytometribasert metode for å oppdage globale HPTM og kan utføres ved hjelp av celler i kultur eller isolerte celler fra in vivo vev. Vi presenterer eksempeldata fra isolert musehjernemikroglia for å demonstrere følsomheten til analysen for å oppdage globale skift i HPTM som respons på en bakterieavledet immunstimulus (lipopolysakkarid). Denne protokollen muliggjør rask og kvantitativ vurdering av HPTM og kan brukes på enhver transkripsjonell eller epigenetisk regulator som kan detekteres av et antistoff.
Epigenetikk er studiet av mekanismene som regulerer genuttrykk uten å endre den underliggende DNA-sekvensen. Epigenetisk regulering av genuttrykk er dynamisk i celler og kan muliggjøre raske og koordinerte responser på ulike miljøstimuli. Den dynamiske reguleringen skjer delvis på grunn av endringer i kromatinstrukturen på nukleosomnivået, som består av histonproteiner (H2A, H2B, H3, H4) samlet i en oktamerkjerne tett viklet av DNA1. Samspillet mellom histonproteinene og DNA kan kontrollere tilgjengeligheten av DNA til transkripsjonsmaskineri, som til slutt kan kontrollere genuttrykk og andre aspekter av kromatinbiologi2. Histonproteiner har ustrukturerte haler som har positivt ladede rester som danner elektrostatiske interaksjoner med den negativt ladede DNA-ryggraden. Disse interaksjonene resulterer i tett pakking av DNA og redusert DNA-tilgjengelighet. Kovalente modifikasjoner av histonhalene, kalt histon posttranslasjonelle modifikasjoner (HPTM), kan regulere disse interaksjonene 3,4. Noen av de mest karakteriserte HPTM-ene inkluderer histonhalacetylering og metylering, noe som kan endre affiniteten til elektrostatiske interaksjoner mellom histonhaler og DNA, noe som resulterer i differensiell tilgjengelighet til det underliggende DNA og rekruttering av transkripsjonsfaktorer som gjenkjenner disse HPTM-ene på bestemte steder. HPTM er regulert av tre viktige klasser av enzymer som kalles lesere – som gjenkjenner, forfattere – som innskudd og viskelær – som fjerner HPTM. Dermed kan rekruttering eller oppløsning av leser-, forfatter- eller viskelærenzymer til slutt endre landskapet til HPTM og styre strukturen og funksjonen til kromatin, noe som gjør regulering og avlesning avgjørende for å forstå cellulær biologi og funksjon 3,4.
Cellene i sentralnervesystemet (CNS) er epigenetisk fleksible når de endrer transkriptomet for å tilpasse seg miljøstimuli. Akkumulerende bevis tyder på at endringer i epigenomet, som DNA-metylering, ikke-kodende RNA og HPTM, spiller en viktig rolle i minnedannelse og synaptisk funksjon5. Å forstyrre HPTM-dynamikken gjennom manipulering av relevante lesere, forfattere eller viskelær kan blokkere eller forbedre assosiativ læring og langsiktig potensiering 6,7,8. Mikroglia, den bosatte immuncellen til CNS, regulerer raskt transkriptomet som respons på immunstimulering gjennom dynamiske endringer i epigenomet 9,10,11. Denne høye tilpasningen til deres lokale hjernemiljø gjør dem vanskelige å undersøke i en isolert kontekst, da studier har vist at epigenomet og transkriptomet til mikroglia blir endret etter bare noen få timer i kulturmedier etter fjerning fra hjernemiljøet11. I tillegg, da mikroglia bare utgjør 10% av hjernens celler, mangler tiltak som undersøker endringer på hele vevsnivå sensitivitet og spesifisitet12,13. Som et resultat må mikroglia raskt isoleres for å undersøke epigenetiske endringer som HPTM-nivåer, ex vivo.
Metodene som vanligvis brukes til å undersøke HPTM, inkluderer kromatin-immunutfellingssekvensering (ChIP-seq) og spaltning under mål og tagmentasjonssekvensering (CUT&Tag-seq)4. Selv om disse teknikkene er svært spesifikke for en individuell HPTM og kan informere tilstedeværelsen av HPTM innenfor en bestemt genomisk kontekst, kan de bare undersøke en av de mange mulige HPTM-ene i et enkelt eksperiment 11,14 Derfor, før du fortsetter med slike eksperimenter, som krever en betydelig tid og pengeinvestering, er det svært verdifullt å begrense listen over potensielt interessante HPTM-er for videre undersøkelse ved først å undersøke endringer i globale nivåer av HPTM. De to hovedtilnærmingene for å undersøke globale HPTM-nivåer er immunhistokjemi og western blot-analyse, men begge tilnærmingene er bare semi-kvantitative, lave gjennomstrømning, og krever et stort antall vevsseksjoner eller isolerte celler15,16. Derfor hadde vi som mål å utvikle en svært sensitiv, kvantitativ metode som kunne brukes til å undersøke de globale HPTM-nivåene raskt og på enkeltcellenivå.
Protokollen som presenteres muliggjør deteksjon av globale HPTM-nivåer raskt ved bruk av intranukleær flowcytometri. Tidligere studier på kreftceller har begrunnet viktigheten av å undersøke globale nivåer fra et klinisk perspektiv17,18. Det er også vanlig at studier bruker globale nivåer som screeningmetode før man vurderer genomisk lokalisering av spesifikke HPTM av interesse19,20. For mikroglia er det utfordrende å vurdere globale nivåer etter isolasjon på grunn av det lave celleutbyttet; Pan et al presenterer globale HPTM-nivåer fra isolert mikroglia, hvor mikroglia fra tre dyr ble samlet for å muliggjøre proteinnivådeteksjon av western blot19. Ved hjelp av protokollen vår er vi i stand til å oppdage globale endringer med mye lavere celleinnganger, noe som muliggjør screening av flere merker per dyr og eliminerer behovet for å samle prøver.
Her beskriver vi en protokoll for å oppdage HPTM-nivåer raskt via kvantitativ intranukleær flowcytometri i isolert mikroglia. Mens vi fokuserer spesielt på HPTM-kvantifisering for korthets skyld, kan denne protokollen brukes på samme måte for å kvantifisere globale nivåer av leser-, forfatter- og viskelærenzymer. Protokollen leveres i to deler: for det første isolasjonsmetoden for mikroglia og for det andre den flowcytometribaserte metoden for bestemmelse av HPTM-nivåer. Isolasjonsmetoden gir celler som kan brukes til både RNA-isolasjon og HPTM-nivåvurdering som muliggjør evaluering av genuttrykk og HPTM-nivåer fra samme prøve. I tillegg kan metoden for HPTM-vurdering brukes på andre celletyper som angitt i protokollen.
Protokollen som presenteres muliggjør kvantitativ vurdering av globale HPTM-nivåer gjennom flowcytometri. Mens denne protokollen presenterer en ny metode, har tidligere studier gjort kvantitativ vurdering av proteiner ved hjelp av en lignende tilnærming26. Tidligere metoder som brukes til å vurdere globale nivåer av HPTM inkluderer immunhistokjemi og western blot 16,17,19,20. Den flowcytometribaserte metoden som presenteres er en lett kvantifiserbar metode, mens western blot og immunhistokjemi er semi-kvantitative og har lavere gjennomstrømning. Western blot er avhengig av cellelyse og krever dermed både proteinnormalisering og et lastkontrollprotein som antas å være uendret av den eksperimentelle tilstanden27. Immunhistokjemi er semikvantitativ og svært lav gjennomstrømning da det er vanskelig å kvantitativt vurdere mengden protein uten å undersøke på enkeltcellenivå16. På samme måte, for den isolerte mikroglia, er det en fordel å bruke flowcytometri-metoden på grunn av det begrensede utbyttet, da western blot krever mye større proteininngang19. Kravene til lavt cellenummer tillater at flere fargepaneler kjøres fra samme dyr.
Imidlertid, som med enhver annen metode, er det begrensninger for denne teknikken, inkludert antistoffkostnad og tilgjengelighet, da ikke alle antistoffer fungerer bra i en flowcytometri-innstilling. I tillegg, sammenlignet med immunoblot, er konsentrasjonen av antistoff som kreves mye høyere. Mens multipleksing gjør det mulig for flere antistoffer som skal brukes på samme cellepanel, kan celler ikke strippes av antistoffet etter analyse, og dermed begrense cellebruken til en per antistoffart. Dette er forskjellig fra immunoblot der samme blott kan brukes gjentatte ganger. Avhengig av tilgjengeligheten av antistoffer og antall deteksjonskanaler på et cytometer, vil det imidlertid være mulig å undersøke opptil et dusin merker samtidig.
Den nåværende metoden fanger bare globale nivåer av proteinuttrykk og ikke den spesifikke genomiske plasseringen, og endringer i globale nivåer kan ikke gjenspeile endringer ved individuelle genomiske loci. På samme måte kan mangel på endring i globale nivåer ikke bety at ingen genomiske loci gjennomgår endringer, bare at de globale endringene summen til ingen forskjeller mellom behandlinger. Som sådan er denne teknikken ment å brukes som en skjerm for å identifisere HPTM av interesse for genomisk analyse. I tillegg tillater denne metoden ikke sammenligning på tvers av forskjellige proteinmerker, bortsett fra når den vurderes som en foldeendring til kontroll. Derfor er dette begrenset sammenlignet med en standard kurvebasert metode som ELISA for proteinbestemmelse.
Protokollen som presenteres tilbyr en strategi for å isolere levende hjernemikroglia. Denne protokollen er avhengig av P2RY12-proteinuttrykk for mikrogliaisolering. P2RY12 er imidlertid en homeostatisk markør i mikroglia og kan nedreguleres i sykdomsmodeller, for eksempel 5XFAD22. Derfor, når du bruker et sykdomsmodelldyr, må du velge andre markørproteiner som TMEM119, CD11b eller CD45 for å hjelpe til med isolering av mikroglia23. På samme måte presenterer vi denne protokollen som isolasjon fra hippocampus og/eller cortex. Denne protokollen vil fungere for å isolere mikroglia fra andre hjernegrupper, inkludert hvite materieregioner, men det kan være nødvendig med flere dyr for å skaffe nok mikroglia, avhengig av størrelsen på interesseområdene.
Protokollen som presenteres kan robust isolere levende hjernemikroglia, men det er flere trinn, beskrevet nedenfor, i isolasjonsstadiet som kan redusere celleutbyttet hvis det utføres feil.
Perfusjoner for denne protokollen resulterer i en høyere prosentandel av mikroglia i det immunberikede fragmentet, noe som vil redusere tiden på sortereren. Perfusjon er imidlertid ikke nødvendig, og andre metoder for eutanasi kan brukes ved behov.
Under isolering av mikroglia bør myelin fjernes helt. Flowcytometre er avhengige av at celler kan bevege seg gjennom smale rør i raskt tempo. På grunn av sin viskositet og tendens til å klumpe seg, forårsaker myelin problemer med cytometre, noe som ofte forårsaker tresko som både kan skade utstyret og ødelegge prøven, noe som reduserer utbyttet drastisk. Vær forsiktig med å fjerne alt myelinet under innsamling av immunberikede fragmenter for å unngå problemer nedstrøms.
Platefarging versus rørfarging: I denne protokollen beskrev vi to alternativer for farging av celler i enten 1,5 ml rør eller en 96 brønnplate. Brukstilfellet for hver avhenger av eksperimentet; Imidlertid er generelt rørfarging lavere risiko for å påvirke utbyttet enn platefarging, da flikken risikerer tap av celler hvis det gjøres feil. Platefarging er mye raskere, da aspirering av supernatanten for hvert rør er tidkrevende. Før fiksering (for sortering, etc.), bruk rørfarging for å maksimere utbyttet og redusere risikoen for tap. Men for HPTM-analyse, når celler er løst for intranukleær farging, er pelleten mer stabil, og det er redusert risiko for tap med flicking.
Etablering av diskontinuerlig tetthetsgradient: Ved etablering av lagdelingen er det viktig å sette opp lagene riktig for å oppnå den immunberikede fraksjonen. Hvis lagene forstyrres eller blandes og virker uklare, vil cellene ikke sortere til ønsket plassering, og det vil være vanskelig å oppnå den immunberikede cellefraksjonen. Hvis dette skjer, spinn med tetthetsmediet for å fjerne myelin og samle deretter hele de gjenværende fraksjonene, fortynn med 3 ml FACS-buffer til 1 ml tetthetsmedium og bland godt (dette vil kreve flere rør). Spinn på 500 x g i 10 min med bremsen på 0. Kast supernatanten, og la bare ~300 μL oppløsning. Samle hele prøven og flekken. Dette vil gi redusert sorteringsprosent og høyere tidsbruk på cytometeret, men utbyttet kan likevel være sammenlignbart.
Ved bruk av isolasjonsmetoden er det fordelaktig å kunne samle celler for RNA og for HPTM-evaluering fra samme musehjerne. I denne situasjonen, etter sortering av levende mikroglia, kan celler deles for å tildele en del til RNA-evaluering (minimum inngangsantall celler for å oppnå et anstendig RNA-utbytte er 75.000 celler) og en del for videre flowcytometrianalyse (minimum 10.000 celler per brønn for god bestemmelse av MFI). I dette tilfellet er flowcytometer sortering nødvendig. Men når du bare planlegger å bruke cellene til HPTM-analyse, er sortering ikke nødvendig, og immunfraksjonen kan farges med P2RY12-antistoffet og HPTM-antistoffet. Gating på cytometeret kan da stilles inn for P2RY12 + microglia, som ville bli gjort for strømningssortering, for å analysere bare HPTM-signal i mikroglia. Eliminering av sorteringen gjør at protokollen kan være raskere og mer kostnadseffektiv. I tillegg, hvis evaluering av HPTM fra dyrkede celler, er det tilstrekkelig å starte med fargeprotokollen, og det kreves ingen cellemarkørantistoffer som vist i figur 6. HPTM-evalueringsprotokollen kan brukes til mange celletyper, inkludert dyrkede, primære og IPSC-avledede celler.
Til slutt, mens vi bare har presentert to potensielle bruksområder for mikroglia nedstrøms isolasjon, er det mange andre, inkludert epigenetiske teknikker som ChIP, CUT&Tag og CUT&RUN. Når det gjelder genomiske epigenetiske teknikker, hvor karakterisering av endringer ved spesifikke steder er av interesse, velg spesifikke hemmere for forfattere og viskelær av kromatinmerker11 skreddersydd for forsøkene for å sikre at eventuelle mikrogliale epigenetiske modifikasjoner profilert ikke er tekniske artefakter fra noen trinn i isolasjonsprosedyren som enzymatisk fordøyelse. Ved vurdering av endringer i globale nivåer av epigenetiske merker, for eksempel ved bruk av kvantitativ flowcytometri, forventes eventuelle prosedyreinduserte endringer ikke å være så store at de oppdages på globalt nivå.
Samlet sett gir de diskuterte metodene en ny, enkeltcellemetode for å kvantifisere globale nivåer av histonmodifikasjoner og andre epigenetiske endringer ved flowcytometri. Vi demonstrerte at denne metoden er tilstrekkelig følsom til å oppdage globale endringer i forsterkermarkøren H3K27ac i mikroglia som respons på LPS in vivo. Dette stemmer overens med tidligere ChIP-sekvensering av H3K27ac etter LPS-stimulering som viser dramatisk remodellering av forsterkere som reagerer på LPS28. Anvendelser av denne metoden vil tillate undersøkelse av globale epigenetiske endringer på tvers av forskjellige hjernecelletyper i utvikling og sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Takk til Yanyang Bai for å hjelpe med immunoblottet i figur 5. Dette arbeidet ble støttet av Canadian Institutes for Health Research [CRC-RS 950-232402 til AC]; Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 til AC]; Scottish Rite Charitable Foundation [21103 til AC] og Brain Canada Foundation [AWD-023132 til AC]; University of British Columbia Aboriginal Graduate Fellowship (6481 til MT); British Columbia Graduate Scholarship (6768 til MT); Canadian Open Neuroscience Platform Student Scholar Award (10901 til JK); University of British Columbia fireårig doktorgradsstipend (6569 til JK). Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet.
0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
15 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Falcon | 352196 | |
24-well Clear Not Treated Plates | Costar | 3738 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
96 Well Clear Polystyrene Microplate, clear round bottom, non treated surface | Corning | 3788 | |
Acetyl Histone 3 K9 (C5B11) | Cell Signalling Technology | 9649S | Dilution: 1:100 |
Acetyl Histone H4 K8 (2594) | Cell Signalling Technology | 2594S | Dilution: 1:100 |
Acetyl-Histone H3 K27 (D5E4) | Cell Signalling Technology | 8173S | Dilution: 1:100 |
Acetyl-Histone H3 Lys27 (MA523516) | Invitrogen | MA523516 | Dilution: 1:100 |
Actinomycin D | New England Biolabs | 15021S | |
Anisomycin | New England Biolabs | 2222S | |
Anti-Histone H3 (tri methyl K4) | Abcam | ab213224 | Dilution: 1:100 |
Anti-Lactyl-Histone H4 (Lys 12) Rabbit mAb | PTM Biolabs | PTM-1411RM | Dilution: 1:250 |
Anti-L-Lactyllysine Rabbit pAb | PRM Biolabs | PTM-1401RM | Dilution: 1:250 |
Apc anti-P2RY12 Antibody, Clone: S16007D | BioLegend | 848006 | |
BSA | Tocris | 5217 | |
Cyto-Last Buffer | BioLegend | 422501 | |
dimethylsulfoxide, sterile | Cell Signalling Technology | 12611S | |
DNAse I | STEMCELL Technologies | 07900 | |
Donkey Anti Mouse AlexaFluor488 | Jackson ImmunoResearch | 715-546-150 | Dilution: 1:500 |
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488 | ABclonal | AS035 | Dilution: 1:500 |
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568 | Invitrogen | A10042 | Dilution: 1:500 |
Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421 | BioLegend | 406410 | Dilution: 1:500 |
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
Fisherbrand Disposable PES Filter Unit, 250mL | Fisherbrand | FB12566502 | |
H3K18ac Polyclonal Antibody | Invitrogen | 720095 | Dilution: 1:100 |
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14185052 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175103 | |
Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002) | Abcam | ab6002 | Dilution: 1:100 |
KONTES Dounce Tissue Grinders 125mm 7mL | VWR | 885300-0007 | |
Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb | PTM BIolabs | PTM-1406RM | Dilution: 1:250 |
Lipopolysacharide | Sigma-Aldrich | L5418 | |
Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
OneComp eBeads Compensation Beads | Invitrogen | 01-1111-41 | |
PDS Kit, Papain Vial – Worthington Biochemical | Cedarlane | LK003178 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | GE17-0891-02 | |
Phenol Red | VWR | RC57004 | |
QIAshredder | Qiagen | 79656 | |
Rainbow Fluorescent Particles, 1 peak (3.0-3.4 uM – Mid Range Intensity | BioLegend | 422905 | |
RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Invitrogen | AM12400 | |
Rneasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
Round Bottom Polypropylene Tubes with Caps, 5 mL | Corning | 352063 | |
Triptolide | New England Biolabs | 97539 | |
True Nuclear Transcription Factor Buffer Set | BioLegend | 424401 | |
TruStain FcX PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 156604 | |
Trypan Blue | VWR | 97063-702 | |
Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 |