Detta arbete beskriver ett protokoll för kvantifiering av globala histonmodifieringar med hjälp av intranukleär flödescytometri i isolerade hjärnmikroglia. Verket innehåller även det protokoll för isolering av mikroglia som användes för datainsamlingen.
Kontroll av genuttryck sker delvis genom modifieringar i kromatinstrukturen, inklusive tillägg och avlägsnande av posttranslationella modifieringar av histonsvansar. Histone post-translational modifications (HPTM) kan antingen underlätta genuttryck eller repression. Till exempel neutraliserar acetylering av histonsvanslysinrester den positiva laddningen och minskar interaktioner mellan svansen och negativt laddat DNA. Minskningen av interaktioner mellan histonsvans och DNA resulterar i ökad tillgänglighet av det underliggande DNA:t, vilket möjliggör ökad tillgång till transkriptionsfaktorer. Acetyleringsmärket fungerar också som en igenkänningsplats för bromodomäninnehållande transkriptionsaktivatorer, vilket tillsammans resulterar i förbättrat genuttryck. Histonmärken kan regleras dynamiskt under celldifferentiering och som svar på olika cellulära miljöer och stimuli. Medan nästa generations sekvenseringsmetoder har börjat karakterisera genomiska platser för enskilda histonmodifieringar, kan endast en modifiering undersökas samtidigt. Med tanke på att det finns hundratals olika HPTM:er har vi utvecklat ett kvantitativt mått på globala HPTM:er med hög genomströmning som kan användas för att screena histonmodifieringar innan vi genomför mer omfattande genomsekvenseringsmetoder. Detta protokoll beskriver en flödescytometribaserad metod för att detektera globala HPTM och kan utföras med hjälp av celler i odling eller isolerade celler från in vivo-vävnader . Vi presenterar exempeldata från isolerade mikroglia i mushjärna för att demonstrera analysens känslighet för att upptäcka globala förändringar i HPTM som svar på en bakterie-härledd immunstimulus (lipopolysackarid). Detta protokoll möjliggör snabb och kvantitativ bedömning av HPTM och kan tillämpas på alla transkriptionella eller epigenetiska regulatorer som kan detekteras av en antikropp.
Epigenetik är studiet av de mekanismer som reglerar genuttryck utan att förändra den underliggande DNA-sekvensen. Epigenetisk reglering av genuttryck är dynamisk i celler och kan möjliggöra snabba och samordnade svar på olika miljöstimuli. Den dynamiska regleringen sker delvis på grund av förändringar i kromatinstrukturen på nukleosomnivå, som består av histonproteiner (H2A, H2B, H3, H4) sammansatta till en oktamerkärna tätt lindad av DNA1. Interaktionerna mellan histonproteinerna och DNA:t kan styra tillgängligheten av DNA till transkriptionsmaskineriet, vilket i slutändan kan styra genuttryck och andra aspekter av kromatinbiologi2. Histonproteiner har ostrukturerade svansar som har positivt laddade rester som bildar elektrostatiska interaktioner med den negativt laddade DNA-ryggraden. Dessa interaktioner resulterar i tät packning av DNA och minskad DNA-tillgänglighet. Kovalenta modifieringar av histonsvansarna, så kallade histon post-translational modifications (HPTM), kan reglera dessa interaktioner 3,4. Några av de mest välkarakteriserade HPTM:erna inkluderar histonsvansacetylering och metylering, vilket kan förändra affiniteten hos elektrostatiska interaktioner mellan histonsvansarna och DNA, vilket resulterar i differentiell tillgänglighet till det underliggande DNA:t och rekrytering av transkriptionsfaktorer som känner igen dessa HPTM på specifika platser. HPTM regleras av tre viktiga klasser av enzymer som kallas läsare – som känner igen, författare – som deponerar och suddgummi – som tar bort HPTM. Således kan rekrytering eller upplösning av läsar-, skrivar- eller suddgummienzymer i slutändan förändra landskapet för HPTM och styra kromatinets struktur och funktion, vilket gör deras reglering och avläsning avgörande för att förstå cellulär biologi och funktion 3,4.
Cellerna i det centrala nervsystemet (CNS) är epigenetiskt flexibla eftersom de ändrar sitt transkriptom för att anpassa sig till miljöstimuli. Ackumulerade bevis tyder på att förändringar i epigenomet, såsom DNA-metylering, icke-kodande RNA och HPTM, spelar en viktig roll i minnesbildning och synaptisk funktion5. Att störa HPTM-dynamiken genom manipulation av relevanta läsare, skribenter eller suddgummin kan blockera eller förbättra associativ inlärning och långsiktig potentiering 6,7,8. Mikroglia, den inneboende immuncellen i CNS, reglerar snabbt sitt transkriptom som svar på immunstimulering genom dynamiska förändringar i deras epigenom 9,10,11. Denna höga nivå av anpassning till den lokala hjärnmiljön gör dem svåra att undersöka i ett isolerat sammanhang, eftersom studier har visat att mikroglias epigenom och transkriptom förändras redan efter några timmar i odlingsmedia efter avlägsnande från hjärnmiljön11. Dessutom, eftersom mikroglia bara utgör 10 % av hjärnans celler, saknar mätningar som undersöker förändringar på hela vävnadsnivå sensitivitet och specificitet12,13. Som ett resultat av detta måste mikroglia snabbt isoleras för att undersöka de epigenetiska förändringarna, såsom HPTM-nivåer, ex vivo.
De metoder som vanligen används för att undersöka HPTM inkluderar kromatin-immunoprecipitationssekvensering (ChIP-seq) och klyvning under targets och tagmentationssekvensering (CUT&Tag-seq)4. Även om dessa tekniker är mycket specifika för en enskild HPTM och kan informera om förekomsten av HPTM inom ett specifikt genomiskt sammanhang, kan de bara undersöka en av de många möjliga HPTM inom ett enda experiment11,14 Innan man går vidare med sådana experiment, som kräver en betydande investering i tid och pengar, är det därför mycket värdefullt att begränsa listan över potentiellt intressanta HPTM för vidare undersökning genom att först undersöka förändringar i globala nivåer av HPTM. De två huvudsakliga metoderna för att undersöka globala HPTM-nivåer är immunhistokemi och western blot-analys, men båda metoderna är endast semikvantitativa, har låg genomströmning och kräver ett stort antal vävnadssnitt eller isolerade celler15,16. Således syftade vi till att utveckla en mycket känslig, kvantitativ metod som kunde användas för att undersöka de globala HPTM-nivåerna snabbt och på encellsnivå.
Protokollet som presenteras möjliggör snabb detektion av globala HPTM-nivåer med hjälp av intranukleär flödescytometri. Tidigare studier på cancerceller har motiverat vikten av att undersöka globala nivåer ur ett kliniskt perspektiv17,18. Det är också vanligt att studier använder globala nivåer som en screeningmetod innan man bedömer genomisk lokalisering av specifika HPTM av intresse19,20. För mikroglia är det svårt att bedöma globala nivåer efter isolering på grund av det låga cellutbytet. Pan et al presenterar globala HPTM-nivåer från isolerade mikroglia, där mikroglia från tre djur poolades för att möjliggöra detektion av proteinnivåer med western blot19. Med hjälp av vårt protokoll kan vi upptäcka globala förändringar med mycket lägre cellingångar, vilket möjliggör screening av flera markeringar per djur och eliminerar behovet av att poola prover.
Här beskriver vi ett protokoll för att snabbt detektera HPTM-nivåer via kvantitativ intranukleär flödescytometri i isolerade mikroglia. Även om vi fokuserar specifikt på HPTM-kvantifiering för korthetens skull, kan detta protokoll användas på samma sätt för att kvantifiera globala nivåer av läsar-, skrivar- och suddgummienzymer. Protokollet levereras i två delar: för det första isoleringsmetoden för mikroglia och för det andra den flödescytometribaserade metoden för bestämning av HPTM-nivåer. Isoleringsmetoden ger celler som kan användas för både RNA-isolering och bedömning av HPTM-nivå, vilket gör det möjligt att utvärdera genuttryck och HPTM-nivåer från samma prov. Dessutom kan metoden för HPTM-bedömning användas på andra celltyper som anges i protokollet.
Protokollet som presenteras möjliggör kvantitativ bedömning av globala HPTM-nivåer genom flödescytometri. Även om detta protokoll presenterar en ny metod, har tidigare studier gjort kvantitativ bedömning av proteiner med hjälp av ett liknande tillvägagångssätt26. Tidigare metoder som använts för att bedöma globala nivåer av HPTM inkluderar immunhistokemi och western blot 16,17,19,20. Den flödescytometribaserade metoden som presenteras är en lätt kvantifierbar metod, medan western blot och immunohistokemi är semikvantitativa och har lägre genomströmning. Western blot förlitar sig på celllys och kräver därför både proteinnormalisering och ett laddningskontrollprotein som antas vara oförändrat av det experimentella betingelsen27. Immunohistokemi är semikvantitativ och mycket låg genomströmning då det är svårt att kvantitativt bedöma mängden protein utan att undersöka på enskild cellnivå16. På samma sätt finns det för de isolerade mikroglia en fördel med att använda flödescytometrimetoden på grund av det begränsade utbytet eftersom western blot kräver mycket större proteintillförsel19. Kraven på lågt cellantal gör det möjligt att köra flera färgningspaneler från samma djur.
Men som med alla andra metoder finns det begränsningar för denna teknik, inklusive antikroppskostnad och tillgänglighet, eftersom inte alla antikroppar fungerar bra i en flödescytometri. Dessutom, jämfört med immunoblot, är koncentrationen av antikroppar som krävs mycket högre. Multiplexering gör det möjligt att använda flera antikroppar på samma cellpanel, men cellerna kan inte tas bort från antikroppen efter analys, vilket begränsar cellanvändningen till en per antikroppsart. Detta skiljer sig från immunoblot där samma blot kan användas upprepade gånger. Beroende på tillgången på antikroppar och antalet detektionskanaler på en cytometer skulle det dock vara möjligt att undersöka upp till ett dussin markeringar samtidigt.
Den nuvarande metoden fångar endast globala nivåer av proteinuttryck och inte den specifika genomiska platsen, och förändringar i globala nivåer kanske inte återspeglar förändringar på enskilda genomiska loci. På samma sätt behöver en brist på förändring i globala nivåer inte betyda att inga genomiska loci genomgår förändringar, bara att de globala förändringarna inte summerar till några skillnader mellan behandlingarna. Som sådan är denna teknik tänkt att användas som en skärm för att identifiera HPTM:er av intresse för genomisk analys. Dessutom tillåter denna metod inte jämförelse mellan olika proteinmarkörer förutom när den bedöms som en veckförändring till kontroll. Därför är detta begränsat jämfört med en standardkurvbaserad metod som ELISA för proteinbestämning.
Protokollet som presenteras erbjuder en strategi för att isolera levande hjärnmikroglia. Detta protokoll förlitar sig på P2RY12-proteinuttryck för mikrogliaisolering. P2RY12 är dock en homeostatisk markör i mikroglia och kan nedregleras i sjukdomsmodeller, såsom 5XFAD22. Därför, när du använder ett sjukdomsmodelldjur, se till att välja andra markörproteiner som TMEM119, CD11b eller CD45 för att hjälpa till att isolera mikroglia23. På samma sätt presenterar vi detta protokoll som isolering från hippocampus och/eller cortex. Detta protokoll skulle fungera för att isolera mikroglia från andra hjärnregioner inklusive regioner med vit substans, men flera djur kan krävas för att få tillräckligt med mikroglia beroende på storleken på de regioner som är av intresse.
Protokollet som presenteras kan på ett robust sätt isolera levande mikroglia i hjärnan, men det finns flera steg, som beskrivs nedan, i isoleringsstadiet som kan minska cellutbytet om de utförs felaktigt.
Perfusioner för detta protokoll resulterar i en högre andel mikroglia i det immunberikade fragmentet, vilket kommer att minska tiden vid sorteringen. Perfusion krävs dock inte, och andra metoder för eutanasi kan användas vid behov.
Under mikrogliaisolering ska myelinet avlägsnas helt. Flödescytometrar är beroende av att cellerna kan färdas genom smala slangar i snabb takt. På grund av sin viskositet och tendens att klumpa ihop sig orsakar myelin problem med cytometrar, vilket ofta orsakar tilltäppningar som både kan skada utrustningen och förstöra provet, vilket minskar utbytet drastiskt. Var försiktig med att ta bort allt myelin under insamling av immunberikade fragment för att undvika problem nedströms.
Plattfärgning kontra rörfärgning: I detta protokoll beskrev vi två alternativ för färgning av celler i antingen 1,5 ml rör eller en 96-hålsplatta. Användningsfallet för var och en beror på experimentet. Generellt sett är dock rörfärgning lägre risk för att påverka avkastningen än plåtfärgning eftersom snärten riskerar att förlora celler om den görs felaktigt. Plattfärgning går mycket snabbare eftersom det är tidskrävande att aspirera supernatanten för varje rör. Före fixering (för sortering etc.), använd rörfärgning för att maximera utbytet och minska risken för förlust. Men för HPTM-analys, när cellerna väl är fixerade för intranukleär färgning, är pelleten mer stabil, och det finns minskad risk för förlust vid snärtning.
Fastställande av den diskontinuerliga densitetsgradienten: När skiktningen etableras är det viktigt att sätta upp skikten på rätt sätt för att erhålla den immunberikade fraktionen. Om skikten störs eller blandas och verkar grumliga, kommer cellerna inte att sortera till önskad plats, och det kommer att vara svårt att erhålla den immunberikade cellfraktionen. Om detta inträffar, snurra med densitetsmediet för att avlägsna myelin och samla sedan upp hela de återstående fraktionerna, späd med 3 ml FACS-buffert till 1 ml densitetsmedium och blanda väl (detta kräver flera rör). Centrifugera 500 x g i 10 min med bromsen på 0. Kassera supernatanten och lämna endast ~300 μL lösning. Samla upp hela provet och färga. Detta kommer att ge i minskade sorteringsprocentsatser och en högre tid som spenderas vid cytometern, men utbytet kan fortfarande vara jämförbart.
Vid användning av isoleringsmetoden är det fördelaktigt att kunna samla in celler för RNA och för HPTM-utvärdering från samma mushjärna. I denna situation, efter sortering av de levande mikroglia, kan celler delas för att allokera en del till RNA-utvärdering (minsta ingångsantal celler för att erhålla ett anständigt RNA-utbyte är 75 000 celler) och en del för ytterligare flödescytometrianalys (minst 10 000 celler per brunn för god bestämning av MFI). I detta fall krävs flödescytometersortering. När man bara planerar att använda cellerna för HPTM-analys krävs dock ingen sortering, och immunfraktionen kan färgas med P2RY12-antikroppen och HPTM-antikroppen. Gating på cytometern kan sedan ställas in för P2RY12+ mikroglia, som skulle göras för flödessortering, för att endast analysera HPTM-signalen inom mikroglia. Genom att eliminera sorteringen kan protokollet bli snabbare och mer kostnadseffektivt. Om HPTM utvärderas från odlade celler räcker det dessutom med att börja med färgningsprotokollet och inga cellmarkörantikroppar krävs, vilket visas i figur 6. HPTM-utvärderingsprotokollet kan användas för många celltyper, inklusive odlade, primära och IPSC-härledda celler.
Slutligen, även om vi bara har presenterat två potentiella användningsområden för mikroglia nedströms isolering, finns det många andra, inklusive epigenetiska tekniker som ChIP, CUT&Tag och CUT&RUN. När det gäller genomiska epigenetiska tekniker, där karakterisering av förändringar på specifika loci är av intresse, välj specifika inhibitorer för författare och raderare av kromatinmärken11 som är skräddarsydda för experimenten för att säkerställa att eventuella mikrogliala epigenetiska modifieringar som profileras inte är tekniska artefakter från några steg i isoleringsproceduren, såsom enzymatisk nedbrytning. Vid bedömning av förändringar i globala nivåer av epigenetiska markörer, till exempel genom att använda kvantitativ flödescytometri, förväntas eventuella procedurinducerade förändringar inte vara så stora att de detekteras på global nivå.
Sammantaget ger de diskuterade metoderna en ny, encellsmetod för att kvantifiera globala nivåer av histonmodifieringar och andra epigenetiska förändringar genom flödescytometri. Vi visade att denna metod är tillräckligt känslig för att detektera globala förändringar i förstärkarmarkören H3K27ac i mikroglia som svar på LPS in vivo. Detta överensstämmer med tidigare ChIP-sekvensering av H3K27ac efter LPS-stimulering som visar dramatisk ombyggnad av förstärkare som svarar på LPS28. Tillämpningar av denna metod kommer att göra det möjligt att undersöka globala epigenetiska förändringar i olika typer av hjärnceller under utveckling och sjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Tack till Yanyang Bai för hjälpen med immunobloten i figur 5. Detta arbete stöddes av Canadian Institutes for Health Research [CRC-RS 950-232402 till AC]; Kanadas forskningsråd för naturvetenskap och teknik [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 till AC]. Scottish Rite Charitable Foundation [21103 till AC] och Brain Canada Foundation [AWD-023132 till AC]; University of British Columbia Aboriginal Graduate Fellowship (6481 till MT); British Columbia Graduate Scholarship (6768 till MT); Canadian Open Neuroscience Platform Student Scholar Award (10901 till JK); University of British Columbia fyraårigt doktorandstipendium (6569 till JK). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om publicering eller förberedelse av manuskriptet.
0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
15 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Falcon | 352196 | |
24-well Clear Not Treated Plates | Costar | 3738 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
96 Well Clear Polystyrene Microplate, clear round bottom, non treated surface | Corning | 3788 | |
Acetyl Histone 3 K9 (C5B11) | Cell Signalling Technology | 9649S | Dilution: 1:100 |
Acetyl Histone H4 K8 (2594) | Cell Signalling Technology | 2594S | Dilution: 1:100 |
Acetyl-Histone H3 K27 (D5E4) | Cell Signalling Technology | 8173S | Dilution: 1:100 |
Acetyl-Histone H3 Lys27 (MA523516) | Invitrogen | MA523516 | Dilution: 1:100 |
Actinomycin D | New England Biolabs | 15021S | |
Anisomycin | New England Biolabs | 2222S | |
Anti-Histone H3 (tri methyl K4) | Abcam | ab213224 | Dilution: 1:100 |
Anti-Lactyl-Histone H4 (Lys 12) Rabbit mAb | PTM Biolabs | PTM-1411RM | Dilution: 1:250 |
Anti-L-Lactyllysine Rabbit pAb | PRM Biolabs | PTM-1401RM | Dilution: 1:250 |
Apc anti-P2RY12 Antibody, Clone: S16007D | BioLegend | 848006 | |
BSA | Tocris | 5217 | |
Cyto-Last Buffer | BioLegend | 422501 | |
dimethylsulfoxide, sterile | Cell Signalling Technology | 12611S | |
DNAse I | STEMCELL Technologies | 07900 | |
Donkey Anti Mouse AlexaFluor488 | Jackson ImmunoResearch | 715-546-150 | Dilution: 1:500 |
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488 | ABclonal | AS035 | Dilution: 1:500 |
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568 | Invitrogen | A10042 | Dilution: 1:500 |
Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421 | BioLegend | 406410 | Dilution: 1:500 |
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
Fisherbrand Disposable PES Filter Unit, 250mL | Fisherbrand | FB12566502 | |
H3K18ac Polyclonal Antibody | Invitrogen | 720095 | Dilution: 1:100 |
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14185052 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175103 | |
Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002) | Abcam | ab6002 | Dilution: 1:100 |
KONTES Dounce Tissue Grinders 125mm 7mL | VWR | 885300-0007 | |
Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb | PTM BIolabs | PTM-1406RM | Dilution: 1:250 |
Lipopolysacharide | Sigma-Aldrich | L5418 | |
Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
OneComp eBeads Compensation Beads | Invitrogen | 01-1111-41 | |
PDS Kit, Papain Vial – Worthington Biochemical | Cedarlane | LK003178 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | GE17-0891-02 | |
Phenol Red | VWR | RC57004 | |
QIAshredder | Qiagen | 79656 | |
Rainbow Fluorescent Particles, 1 peak (3.0-3.4 uM – Mid Range Intensity | BioLegend | 422905 | |
RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Invitrogen | AM12400 | |
Rneasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
Round Bottom Polypropylene Tubes with Caps, 5 mL | Corning | 352063 | |
Triptolide | New England Biolabs | 97539 | |
True Nuclear Transcription Factor Buffer Set | BioLegend | 424401 | |
TruStain FcX PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 156604 | |
Trypan Blue | VWR | 97063-702 | |
Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 |