מיפוי אופטי של לבבות בצבע כפול מעכברי RyR2R2474S של טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית
Summary
פרוטוקול זה מציג מיפוי אופטי דו-צבעי של לבבות עכברים המתקבלים מחיות בר וחיות בר המושפעות מטכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית, כולל מדידות אלקטרופיזיולוגיות של מתח טרנסממברנה וטרנזיאנטים תוך-תאיים Ca2+ ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה.
Abstract
הפרעת הלב הפרו-אריתמית קטכולמינרגי טכיקרדיה חדרית פולימורפית (CPVT) מתבטאת באפיזודות טכיקרדיה חדרית פולימורפית בעקבות פעילות גופנית, מתח או אתגר קטכולאמין, אשר יכול להידרדר לפרפור חדרים שעלול להיות קטלני. לב עכבר הוא מין נפוץ למידול מחלות הפרעות קצב לב תורשתיות, כולל CPVT. מיפוי אופטי סימולטני של פוטנציאל טרנסממברנה (Vm) ומעברי סידן (CaT) מלבבות עכברים מחוררים לנגנדורף הוא בעל פוטנציאל להבהיר מנגנונים העומדים בבסיס הפרעת קצב. בהשוואה לחקירה ברמה התאית, טכניקת המיפוי האופטי יכולה לבדוק כמה פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים, כגון קביעת ההפעלה, מהירות ההולכה, משך פוטנציאל הפעולה ומשך CaT. מאמר זה מציג את מערך המכשור וההליך הניסיוני למיפוי אופטי בתפוקה גבוהה של CaT ו-V m בלבבות מסוג פרא מורין ו-RyR2-R2474S/+ הטרוזיגוטיים, בשילוב עם קצב חשמלי מתוכנת לפני ובמהלך אתגר האיזופרוטרנול. גישה זו הדגימה שיטה ישימה ואמינה ללימוד מכניסטי של מחלת CPVT בהכנת לב עכבר ex vivo.
Introduction
הפרעת לב תורשתית טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית (CPVT) מתבטאת באפיזודות טכיקרדיה חדרית פולימורפית (PVT) בעקבות פעילות גופנית, מתח או אתגר קטכולאמין, אשר יכולות להידרדר לפרפור חדרים שעלול להיות קטלני 1,2,3,4 . עדויות עדכניות בעקבות הדו”ח הראשון שלה כתסמונת קלינית בשנת 1995 היו מוטציות מעורבות בשבעה גנים, כולם מעורבים בשחרור רשתית סרקופלזמית (SR) Ca 2+ במצב זה: הדיווח הנפוץ ביותר על RYR2 המקודד קולטן ריאנודין 2 (RyR2) של Ca2+ ערוצי שחרור5,6, FKBP12.67, CASQ2 המקודד calsequestrin לב8, TRDN קידוד החלבון SR טריאדין 9, ו- CALM1 9, CALM2 10 ו- CALM3 מקודד באופן זהה קלמודולין11,12. דפוסים גנוטיפיים אלה מייחסים את האירועים הריתמיים לשחרור פתולוגי בלתי מווסת של חנות SR Ca2+12.
שחרור ספונטני של Ca 2+ מ-SR יכול להיות מזוהה כניצוצות Ca 2+ או גלי Ca 2+, אשר מפעיל את מחליף Na+/Ca 2+ (NCX). המחליף של Ca2+ אחד לשלושה Na+ מייצר זרם פנימי, אשר מאיץ את הדפולריזציה הדיאסטולית ומניע את מתח הממברנה לסף פוטנציאל הפעולה (AP). בעכברי RyR2, הפעילות המוגברת של RyR2R4496C בצומת הסינואפרוזדורי (SAN) מובילה לירידה בלתי צפויה באוטומטיות של SAN על ידי ירידה תלוית Ca 2+ של דלדול I Ca,L ו- SR Ca2+ במהלך דיאסטולה, זיהוי שינויים פתופיזיולוגיים תת-תאיים התורמים לתפקוד לקוי של SAN בחולי CPVT13,14. הופעה של גלי Ca 2+ ציטוסוליים הקשורים לקרדיומיוציטים היא סבירה יותר בעקבות עלייה בציטוסוליים ברקע [Ca2+] בעקבות רגישות RyR על ידי קטכולאמין, כולל איזופרוטרנול (ISO), אתגר.
שינויים קינטיים מפורטים באיתות Ca 2+ בעקבות שחרור Ca2+ בתיווך RyR2 בתגובה להפעלת פוטנציאל פעולה (AP) שעשויים להיות הגורם להפרעות קצב חדריות שנצפו במודלים שלמים של CPVT לב נותרו לקביעה עבור הטווח המלא של גנוטיפים מדווחים של RyR212. מאמר זה מציג את מערך המכשור ואת ההליך הניסיוני למיפוי בתפוקה גבוהה של אותות Ca2+ ופוטנציאלים טרנסממברנליים (Vm) בלבבות מסוג בר מורין (WT) ו- RyR2-R2-R2474S/+ הטרוזיגוטיים, בשילוב עם קצב חשמלי מתוכנת לפני ואחרי אתגר איזופרוטרנול. פרוטוקול זה מספק שיטה למחקר מכניסטי של מחלת CPVT בלבבות עכברים מבודדים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהתבסס על הניסיון שלנו, המפתחות למיפוי אופטי מוצלח של לב עכבר בצבע כפול כוללים פתרון מוכן היטב ולב, טעינת צבע, השגת יחס אות לרעש הטוב ביותר והפחתת חפץ התנועה.
הכנת פתרון
פתרון קרבס חיוני לניסוי לב מוצלח. תמיסות מלאי MgCl 2 ו- CaCl2 (1 mol/L) מוכנות מראש בהתחשב בספ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81700308 ל- XO ו- 31871181 ל- ML, ו- 82270334 ל- XT), תוכנית התמיכה במדע וטכנולוגיה של מחוז סצ’ואן (CN) (2021YJ0206 ל- XO, 23ZYZYTS0433 ו- 2022YFS0607 ל- XT, ו- 2022NSFSC1602 ל- TC) ומעבדת מפתח המדינה לכימיה והנדסה מולקולרית של משאבים רפואיים (אוניברסיטת גואנגשי הרגילה) (CMEMR2017-B08 ל- XO), MRC (G10031871181 עד ML02647, G1002082, מ”ל), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE באוקספורד (ML).
Materials
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
References
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
- Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
- Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
- Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
- Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
- Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., Adam, M. P., et al. CACNA1C-related disorders. GeneReviews. , (1993).
- Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
- Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
- Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
- Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
- Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
- O’Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
- O’Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
- Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
- Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
- Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
- Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- O’Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
- Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
- Mal Baudot, ., et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
- Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
- Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
- Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
- Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
- He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
- Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).
