Cartographie optique à double colorant des cœurs de souris knock-in RyR2R2474S de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique
Summary
Ce protocole introduit une cartographie optique à double colorant des cœurs de souris obtenus à partir d’animaux de type sauvage et knock-in atteints de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique, y compris des mesures électrophysiologiques de la tension transmembranaire et des transitoires intracellulaires Ca2+ avec une haute résolution temporelle et spatiale.
Abstract
La tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique (TVPC) se manifeste par des épisodes de tachycardie ventriculaire polymorphe à la suite d’une activité physique, d’un stress ou d’un défi aux catécholamines, qui peuvent se détériorer en fibrillation ventriculaire potentiellement mortelle. Le cœur de souris est une espèce répandue pour modéliser les maladies arythmiques cardiaques héréditaires, y compris la TVPC. La cartographie optique simultanée du potentiel transmembranaire (Vm) et des transitoires calciques (CaT) à partir de cœurs de souris perfusés par Langendorff a le potentiel d’élucider les mécanismes sous-jacents à l’arythmogenèse. Par rapport à l’étude au niveau cellulaire, la technique de cartographie optique peut tester certains paramètres électrophysiologiques, tels que la détermination de l’activation, de la vitesse de conduction, de la durée du potentiel d’action et de la durée du CaT. Cet article présente le dispositif d’instrumentation et la procédure expérimentale pour la cartographie optique à haut débit du CaT et de la Vm dans des cœurs murins de type sauvage et hétérozygote RyR2-R2474S/+, combinés à une stimulation électrique programmée avant et pendant le défi isoprotérénol. Cette approche a démontré une méthode réalisable et fiable pour étudier mécanistiquement la maladie CPVT dans une préparation ex vivo de cœur de souris.
Introduction
La tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique héréditaire (TVPC) se manifeste par des épisodes de tachycardie ventriculaire polymorphe (TVP) à la suite d’une activité physique, d’un stress ou d’une provocation aux catécholamines, qui peuvent se détériorer en fibrillation ventriculaire potentiellement mortelle 1,2,3,4 . Des preuves récentes à la suite de son premier rapport en tant que syndrome clinique en 1995 ont impliqué des mutations dans sept gènes, tous impliqués dans la libération de Ca 2+ dans le stockage réticulaire sarcoplasmique (SR) dans cette condition : le récepteur RYR2 codant pour la ryanodine 2 (RyR2) le plus fréquemment rapporté des canaux de libération de Ca2+5,6, FKBP12.67, CASQ2 codant pour la calséquestrinecardiaque 8, TRDN codant pour la protéine jonctionnelle SR triadine 9, et CALM1 9, CALM2 10 et CALM3 codant de manière identique pour la calmoduline11,12. Ces profils génotypiques attribuent les événements arythmiques à la libération pathologique non régulée de SR stock Ca2+12.
La libération spontanée de Ca 2+ par SR peut être détectée sous forme d’étincelles de Ca 2+ ou d’ondes de Ca 2+, ce qui active l’échangeur Na+/Ca 2+ (NCX). L’échangeur d’un Ca2+ pour trois Na+ génère un courant entrant, qui accélère la dépolarisation diastolique et conduit la tension membranaire jusqu’au seuil du potentiel d’action (PA). Chez les souris knock-in RyR2, l’activité accrue de RyR2R4496C dans le nœud sino-auriculaire (SAN) conduit à une diminution inattendue de l’automaticité du SAN par une diminution dépendante du Ca 2+ de l’épuisement de l’ICa,L et du SR Ca2+ pendant la diastole, identifiant des altérations physiopathologiques subcellulaires contribuant au dysfonctionnement du SAN chez les patients atteints de CPVT13,14. L’apparition des ondes cytosoliques Ca 2+ cardiomyocytaires associées est plus probable après l’augmentation du cytosolique de fond [Ca2+] à la suite de la sensibilisation RyR par la catécholamine, y compris l’isoprotérénol (ISO).
Les changements cinétiques détaillés dans la signalisation du Ca 2+ après la libération de Ca2+ médiée par RyR2 en réponse à l’activation du potentiel d’action (PA) qui pourrait être la cause des arythmies ventriculaires observées dans les modèles de CPVT cardiaque intacts restent à déterminer pour l’ensemble des génotypes RyR2 rapportés12. Cet article présente le dispositif d’instrumentation et la procédure expérimentale pour la cartographie à haut débit des signaux Ca2+ et des potentiels transmembranaires (Vm) dans les cœurs murins de type sauvage (WT) et hétérozygotes RyR2-R2474S/+, combinés à une stimulation électrique programmée avant et après le défi isoprotérénol. Ce protocole fournit une méthode pour l’étude mécanistique de la maladie CPVT dans des cœurs de souris isolés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sur la base de notre expérience, les clés d’une cartographie optique à double colorant réussie d’un cœur de souris comprennent une solution et un cœur bien préparés, la charge du colorant, l’obtention du meilleur rapport signal/bruit et la réduction de l’artefact de mouvement.
Préparation de la solution
La solution de Krebs est essentielle pour la réussite d’une expérience cardiaque. Les solutions mères de MgCl 2 et de CaCl2 (1 mol/L) sont …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude est soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81700308 à XO et 31871181 à ML, et 82270334 à XT), le Programme de soutien à la science et à la technologie (CN) de la province du Sichuan (2021YJ0206 à XO, 23ZYZYTS0433 et 2022YFS0607 à XT et 2022NSFSC1602 à TC) et le Laboratoire d’État clé pour la chimie et l’ingénierie moléculaire des ressources médicinales (Université normale du Guangxi) (CMEMR2017-B08 à XO), MRC (G10031871181 à ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE à Oxford (ML) subventions.
Materials
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
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