Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルスシングルガイドRNAシステムを組み合わせた褐色脂肪特異的ノックアウトマウスの作製
Summary
このプロトコルでは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)シングルガイドRNA(sgRNA)システムを組み合わせて褐色脂肪組織(BAT)特異的ノックアウトマウスを生成するための技術的手順について説明します。記載されたステップには、sgRNAの設計、AAV-sgRNA粒子の調製、およびBATローブへのAAVのマイクロインジェクションが含まれる。
Abstract
褐色脂肪組織(BAT)は、エネルギー散逸に特化した脂肪貯蔵庫であり、生理活性分子の分泌 を介して 内分泌器官としても機能します。BAT特異的ノックアウトマウスの作成は、BATを介したエネルギー調節に対する目的の遺伝子の寄与を理解するための最も一般的なアプローチの1つです。Cre-LoxPシステムを利用した従来の遺伝子ターゲティング戦略は、組織特異的ノックアウトマウスを作製するための主要なアプローチでした。ただし、このアプローチは時間がかかり、面倒です。ここでは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)シングルガイドRNA(sgRNA)システムを組み合わせて、BATの目的遺伝子を迅速かつ効率的にノックアウトするためのプロトコルについて説明します。肩甲骨間BATは、筋肉間の深い層にあります。したがって、視野内のBATにAAVを正確かつ直接注入するには、BATを露光する必要があります。BATにつながるスルツァー静脈などの交感神経や血管の損傷を防ぐためには、適切な外科的取り扱いが不可欠です。組織の損傷を最小限に抑えるには、BATの3次元解剖学的位置と技術的ステップで必要な外科的スキルを理解することが重要です。このプロトコルは、目的の遺伝子を標的とするsgRNAの設計、AAV-sgRNA粒子の調製、BAT特異的ノックアウトマウスを生成するための両方のBATローブへのAAVの直接マイクロインジェクション手術など、主要な技術的手順を強調しており、BATの遺伝子の生物学的機能の研究に広く適用できます。
Introduction
肥満は世界中でかなりの速度で増加しており、広範囲の代謝性疾患につながっています1,2,3。脂肪組織はこれらの病状の鍵です。存在する2つの機能的に異なるタイプの脂肪組織は、過剰なカロリーを蓄える白色脂肪組織(WAT)と、熱発生のためにエネルギーを放散する褐色脂肪組織(BAT)とそれに関連するベージュ/ブライト脂肪です。BATはそのエネルギー放散機能で認識されていますが、遠位器官の代謝を調節する生理活性分子の生成を介して内分泌機能も持っています4,5。げっ歯類での多くの研究は、茶色またはベージュ色の脂肪の量または活性を増加させることがエネルギー消費の増加とインスリン感受性の改善につながることを示しています。ヒトでは、BATの検出可能な人は心代謝疾患の有病率が有意に低くなります6。したがって、BATは、肥満関連代謝後遺症7、8、9に対して優れた治療可能性を秘めています。
BATの発生と機能の生理学と病態生理学を調査し、これらのプロセスに関与する分子メカニズムを解明するために、BAT特異的トランスジェニックマウスモデルが最適な方法です10。Cre-LoxP組換えシステムは、マウスゲノムを編集することによって条件付きノックアウトマウスを作製するための最も一般的に使用される手段です。このシステムは、組織/細胞特異的な方法で目的の遺伝子の修飾(過剰発現またはノックアウト)を可能にしました11。また、選択的蛍光レポーター遺伝子を発現させることにより特定の細胞型を標識するために利用することもできる。
最近、Cre−LoxPシステムアプローチは、CRISPR-Cas9技術とアデノ随伴ウイルス(AAV)シングルガイドRNA(sgRNA)システムを組み合わせることによってさらに発展している12。CRISPR-Cas9システムは、ゲノム13の正確な領域を改変、調節、または標的化するための特異的で効率的な遺伝子編集ツールです。CRISPR-Cas9ベースのゲノム編集は、遺伝子ターゲティングベクターとの相同組換えを必要としないため、ゲノム遺伝子座の迅速な遺伝子操作を可能にします。Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびAAV-sgRNA技術を組み合わせることで、研究者は組織/細胞における所望の時間における目的の遺伝子の役割を調査できるため、遺伝子機能をより正確に理解することができます。さらに、これらの組み合わせた技術は、トランスジェニックマウスの生成に必要な時間と労力を削減し、誘導性Cre系統が使用されている場合、マウスにおける誘導性ゲノム編集のためのCRISPR-Cas9活性の時間的制御を可能にする14。
AAVベクターは、安全で効果的なin vivo遺伝子デリバリーシステムです。しかし、脂肪組織を標的とするAAVは、脳、心臓、肝臓、筋肉などの他の組織での応用に遅れをとっています15。形質導入効率が比較的低く、天然に存在する血清型ベクターでは向性が強いため、脂肪組織へのAAV誘導遺伝子送達は依然として困難です15。過去5年間で、私たちらは、AAVガイド下遺伝子を脂肪組織に送達するための効果的で低侵襲な方法を確立することに成功し、BAT機能の調節に関与する遺伝子の理解を可能にするマウスモデルを作成しました16,17,18,19。例えば、AAV8を用いて、12-リポキシゲナーゼ(12-LOX)をコードするAlox12を標的とするsgRNAをUcp1-Cre/Cas9マウスのBATに送達することにより、活性化されたBATが12-LOX代謝物、すなわち12-ヒドロキシ-エイコサペンタエン酸(12-HEPE)と13R,14S-ジヒドロキシドコサヘキサエン酸(マレジン2)を産生し、それぞれグルコース代謝を調節し、肥満関連炎症を解消することを発見しました16。17.ここでは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびAAV-sgRNAシステムを組み合わせてBAT特異的ノックアウトマウスを生成するための技術的手順、特にAAV-sgRNAをBATローブに直接マイクロインジェクションする手術に関する段階的なプロトコルを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
肩甲骨間BATへのAAV媒介遺伝子送達のための既存の公開された方法には、BATへのAAV直接注入のための外科的技術とアプローチを説明する詳細な写真とビデオは含まれていません。公表された方法33,34のほとんどにおいて、AAVは、BAT自体ではなく、肩甲骨間BAT周囲の脂肪組織に注入される。したがって、このプロトコルには、研究の成功を決定するいく…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究の一部は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R01DK122808、R01DK102898、およびR01DK132469(Y.-H.T.へ)、およびP30DK036836(ジョスリン糖尿病センターの糖尿病研究センターへ)によって支援されました。T. T.は、サンスター・リサーチ・フェローシップ(金田博夫奨学金、サンスター財団)および米国心臓協会助成金903968の支援を受けました。Y.Z.はチャールズA.キングトラストフェローシップによってサポートされました。原稿を校正してくださったショーン・D・コダニに感謝します。
Materials
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
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