Denna artikel beskriver ett protokoll för generering av humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda neuroner i en bänkskiva 3D-suspensionsbioreaktor.
Härledningen av neuronala härstamningsceller från humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) markerade en milstolpe i hjärnforskningen. Sedan deras första tillkomst har protokoll kontinuerligt optimerats och används nu i stor utsträckning inom forskning och läkemedelsutveckling. Den mycket långa varaktigheten av dessa konventionella differentierings- och mognadsprotokoll och den ökande efterfrågan på högkvalitativa hiPSC och deras neurala derivat ökar dock behovet av att anta, optimera och standardisera dessa protokoll till storskalig produktion. Detta arbete presenterar ett snabbt och effektivt protokoll för differentiering av genetiskt modifierade, doxycyklininducerbara neurogenin 2 (iNGN2)-uttryckande hiPSC till neuroner med användning av en bänkskiva tredimensionell (3D) suspension bioreaktor.
I korthet tilläts encellssuspensioner av iNGN2-hiPSC bilda aggregat inom 24 timmar, och neuronalt härstamningsengagemang inducerades genom tillsats av doxycyklin. Aggregat dissocierades efter 2 dagars induktion och cellerna frystes antingen eller ompläterades för terminal mognad. De genererade iNGN2-neuronerna uttryckte klassiska neuronala markörer tidigt och bildade komplexa neuritiska nätverk inom 1 vecka efter omplätering, vilket indikerar en ökande mognad av neuronala kulturer. Sammanfattningsvis tillhandahålls ett detaljerat steg-för-steg-protokoll för snabb generering av hiPSC-härledda neuroner i en 3D-miljö som har stor potential som utgångspunkt för sjukdomsmodellering, fenotypiska läkemedelsscreeningar med hög genomströmning och storskalig toxicitetstestning.
Neurologiska störningar är den främsta orsaken till funktionshinder över hela världen1. En av sex personer drabbas, och förekomsten fortsätter att öka. Den ekonomiska bördan för samhällen och deras hälso- och sjukvårdssystem är enorm. I en utvärdering av 30 europeiska länder 2010 uppskattades årliga kostnader på 800 miljarder euro för psykiska och neurologiska störningar2. Den ökande samhällsekonomiska bördan kräver effektiva behandlingsstrategier, och även om vår förståelse för sjukdomspatofysiologi har ökat kraftigt är översättningen till kliniker ofta otillräcklig. I allmänhet går endast 12 % av läkemedlen in i kliniska prövningar, varav mer än 80 % misslyckas under senare skeden, främst på grund av ineffektivitet eller oförutsedd toxicitet 3,4. Orsakerna varierar, men den begränsade överförbarheten från djurförsök i prekliniska stadier till försök på människor har i allt högre grad aktualiserats5. Humana in vitro-cell– och vävnadsmodeller kan överbrygga klyftan mellan arttranslation, och framsteg inom humaninducerad pluripotent stamcellsteknik (hiPSC) har stor potential i detta avseende. hiPSC används i stor utsträckning inom grundforskning och delar väsentliga egenskaper med embryonala stamceller (hESC), såsom en nästan obegränsad självförnyelsekapacitet och förmågan att differentiera till alla tre könsskikt6, samtidigt som man kringgår etiska problem i samband med embryoförstöring.
Härledningen av neuronala celler från hESC, och senare hiPSCs, markerade en milstolpe i hjärnforskningen. Initiala differentieringsprotokoll baserades på tillämpningen av tillväxtfaktorer som efterliknar kritiska steg under embryogenesen, de flesta av dem involverade dubbel SMAD-hämning antingen i suspension eller vidhäftande kulturer 7,8,9. Mogna neuroner har framgångsrikt genererats, men flera nackdelar med dessa protokoll hindrar fortfarande deras breda användning i läkemedelsutveckling, såsom det låga utbytet och den höga batch-till-batch-variationen hos genererade neuroner, liksom den omfattande arbetsbelastningen relaterad till långa odlingstider. Förbättringar har uppnåtts genom forcerat uttryck av transkriptionsfaktorer som är kritiskt involverade i neurogenes, och medlemmar av neurogeninfamiljen (NGN), särskilt NGN2, har identifierats som effektiva drivkrafter10. Det lentiviralmedierade ektopiska uttrycket av NGN2 i hiPSC accelererade tidiga stadier av neuronal differentiering signifikant och inducerade neuronalt cellöde inom endast 1 vecka11. Efterföljande terminal mognad i samkulturer med astrocyter gav funktionella neuroner i hög renhet och kvantitet med reproducerbara egenskaper. Platsstyrd genredigering av den adenoassocierade virusintegrationsplatsen 1 (AAVS1) safe-harbor-locus applicerades sedan för att skapa hiPSC-linjer med en stabil och doxycyklininducerbar expressionskassett för NGN212,13, vilket minimerar oönskade biverkningar av lentiviral leverans.
Den robusta och effektiva differentieringen av doxycyklininducerbara neurogenin 2 (iNGN2) neuroner har stor potential för fenotypiska läkemedelsscreeningar och toxicitetsanalyser10,14,15; och betydande framsteg inom bioprocessing har gjorts under det senaste decenniet och implementerat bioreaktorer för en skalbar cellexpansion och differentiering16,17,18,19. Majoriteten av differentieringsprotokollen är dock optimerade för vidhäftande kulturer, och översättning till en tredimensionell (3D) miljö kräver ofta väsentliga modifieringar. Nyligen har framgångsrik användning av en bänkskiva 3D-bioreaktor med reducerade skjuvspänningsfunktioner rapporterats för expansion av hiPSC och för reproducerbar differentiering till hepatocyter, kardiomyocyter och neuroner20. Här tillhandahålls ett detaljerat protokoll för generering och karakterisering av iNGN2-neuroner med användning av den identiska bänkskivan 3D-bioreaktorn.
Det ektopiska uttrycket av den neuronala transkriptionsfaktorn NGN2 har tidigare visat sig påskynda tidiga stadier av neuronal differentiering och inducera neuronalt härstamningsengagemang i hiPSC inom 1 vecka efter odling12,13,20. Detta arbete beskriver ett detaljerat protokoll för differentiering av genredigerade BIONi010-C-13 hiPSCs till iNGN2-neuroner med hjälp av en bänkbioreaktor.
CERO 3D-bioreaktorn är en lågvolymbioreaktor med fyra slitsar för specialrör, var och en med en maximal kapacitet på 50 ml. Temperatur- och CO2-nivåerna kontrolleras kontinuerligt och odlingsparametrar (t.ex. rotationshastighet och tid) regleras för varje rör, vilket gör det möjligt för användare att köra flera differentieringsmetoder parallellt. Integrerade vågbrytare på den inre rörväggen möjliggör en störning av mediet med låg skjuvspänning och håller 3D-aggregat i suspension under kontrollerad rotation. Begränsad tillgång till näringsämnen, såväl som påtvingade 3D-cell-cell och cell-extracellulär matris (ECM) interaktioner, kan signifikant påverka celldifferentiering och beteende24,25,26,27.
Odling av celler som 3D-aggregat i suspension ökar dessa cellinteraktioner och efterliknar därmed in vivo-miljön i vävnad eller organ närmare28. Den samtidiga störningen av mediet reglerar aggregatstorleken på grund av mekanisk friktion, förbättrar gasutbytet och minskar gradienten av näringsämnen och avfall i röret, samtidigt som fysiologiska relevanta gradienter bevaras inuti aggregaten 29,30,31,32,33,34. Även om medelbyten utförs manuellt minskar bänkbioreaktorn arbets- och driftskostnaderna jämfört med statiska odlingskolvar. Bioreaktorn erbjuder också flera fördelar jämfört med helautomatiska bioreaktorer med omrörningstank, eftersom den pumphjulsfria konstruktionen minskar den hydrodynamiska skjuvspänningen vid aggregatytan, vilket inte bara förbättrar cellöverlevnaden utan också begränsar effekterna av skjuvspänning på känsliga iPSC, celldifferentiering och funktion35,36,37,38.
Vertikala hjulbioreaktorer, där celler omrörs av ett stort vertikalt pumphjul, liksom gungande rörelsebioreaktorer med uppblåsta odlingspåsar fästa vid en motoriserad plattform, representerar alternativa 3D-upphängningsplattformar. Även om de testats överdrivet för odling av hiPSC 17,18,19,39,40, är lite känt om deras tillämplighet i neuronala differentieringsmetoder, och rapporterna är begränsade till den framgångsrika expansionen av däggdjur och humana neurala prekursorceller i omrörningsbioreaktorer41,42,43,44, med ett sällsynt antal studier som fokuserar på mognad44,45. I allmänhet erbjuder automatiserade 3D-upphängningsplattformar fördelen med helautomatiska och datorstyrda medeländringar, vilket minskar variationer i hanteringen och minimerar risken för kontaminering. Dessutom kan näringsparametrar som laktat och glukoskoncentration övervakas kontinuerligt. Inrättandet av dessa system kräver dock ofta en betydande initial investering, laboratorieutrymme och utbildning av kvalificerad personal. Bänkbioreaktorn representerar ett kompakt och lättanvänt alternativ för odling av celler i suspension, men ger inte samtidig övervakning av näringsämnen.
Som i de flesta protokoll som används för odling av celler i 3D-suspensionsplattformar representerar den initiala bildningen av aggregat ett kritiskt steg. hiPSC odlas som vidhäftande monolager och överförs därefter som encellssuspensioner till en 3D-miljö. För att minimera cellförlust i det skedet måste flera aspekter beaktas. Utformningen av rören med de integrerade vågbrytarna innebär att en minimal odlingsvolym på 10 ml per rör krävs för att säkerställa optimal mediumstörning. Den kritiska volymen bör därför inte underskridas på lång sikt. Dessutom rekommenderas en startsådddensitet på 7,5 miljoner celler per 10 ml odlingsvolym och en rotationshastighet på 60 rpm för att bilda stabila aggregat på kort sikt, även om anpassningar kan vara nödvändiga beroende på cellinjen.
Efter överföring av hiPSC till suspension bör aggregat bildas inom 24 timmar. Den första medieförändringen är kritisk, eftersom aggregaten är små och kanske inte sätter sig ordentligt. Tiden för sedimentering av ballast kan förlängas men bör inte överstiga mer än 10 minuter, eftersom ballast kan börja klumpa ihop sig och växa på ett heterogent sätt. Under aspiration bör en minimal odlingsvolym på 5 ml lämnas i röret, och eventuella störningar av mediet bör undvikas. Icke desto mindre kan en förlust av celler och aggregat förväntas under de inledande faserna. Celltal indikerar ett konstant cellutbyte under de första 2 dagarna i odling, vilket indikerar att hiPSCs höga proliferativa kapacitet kompenserar för den initiala cellförlusten. En gång i suspension leder den mjuka odlingen och störningen till homogent stora aggregat som börjar växa över tiden.
Neuronal differentiering utfördes enligt ett tidigare publicerat protokoll baserat på doxycyklininducerat NGN2-överuttryck13, och de enskilda stegen optimerades för en 3D-odling. Den neuronala transkriptionsfaktorn NGN2 är en väl beskriven drivkraft vid neuronal differentiering och accelererar neuronal induktion signifikant11,13,46. Medan konventionell mönstring med definierade tillväxtfaktorer tar flera veckor till månader 7,8,9, inducerar NGN2-uttryck neuronalt cellöde inom några dagar. Förutom den förkortade odlingstiden beror protokollet varken på dyra tillväxtfaktorer eller beläggningsmatriser för den initiala suspensionskulturen, vilket minskar odlingskostnaderna ytterligare.
Dessutom avslöjade en direkt jämförelse av den NGN2-drivna generationen av omogna neuroner i vidhäftande och suspensionskulturer en 1,36-faldig ökning av celler efter 4 dagar i odling med användning avbänkbioreaktorn 20, medan volymen medium som krävs för generering av 1 miljon celler förväntas halveras. Att använda bänkbioreaktorn för generering av iNGN2-neuroner kan därför vara fördelaktigt, eftersom ett högre antal celler kan produceras med lägre hanteringstid och kostnad. I linje med tidigare rapporter observerades neuronalt härstamningsengagemang tidigt. Efter 2 dagars NGN2-induktion var ett djupt uttryck av klassiska neuronala markörer såsom TUBB3, MAP2 och MAPT uppenbart, vilket stödde användbarheten av bänkbioreaktorn för neuronal induktion. Efter detta protokoll kan cirka 6,2 miljoner omogna iNGN2-neuroner erhållas från 1 miljon hiPSC inom 4 dagar efter odling. Produktionskapaciteten kan dock variera mellan olika partier och beror på suspensionskulturens volym vid sådd.
För att öka avkastningen ytterligare förlängdes odlingstiden med ytterligare 3 dagar; Men även om aggregaten blev större blev de också mycket kompakta och kunde inte ordentligt dissocieras för kryokonservering eller omplätering. Trots framsteg inom 3D-odlingsmetoder är vidhäftande 2D-neuronkulturer fortfarande guldstandarden för funktionella analyser som mikroelektroduppsättningar eller kalciumavbildning. Cellsingularisering är således en viktig förutsättning för ett homogent fördelat neuronalt monolager och neuritiskt nätverk. Starkare mekanisk avlossning av cellerna eller hårda dissociationsreagens kan användas för att säkerställa singularisering, men med potentiella effekter på cellviabilitet, fysiologi och återbindningskapacitet47,48. När det gäller behovet av enstaka celler för vidare analyser och mognad dissocierades aggregat efter 4 dagar i suspension, och (dag 2) iNGN2-neuronerna kryokonserverades. Post-tina differentiering och karakterisering av iNGN2-neuroner bekräftade en ökande mognad hos neuronkulturerna och bildandet av ett tätt neuritiskt nätverk.
Det tillhandahållna protokollet ger ett stort antal iNGN2-neuroner. Flera begränsningar måste dock beaktas. Som för de flesta suspensionskulturplattformar är överföringen av hiPSC från en 2D-vidhäftande kultur till en 3D-miljö kritisk och ofta förknippad med en djup cellförlust. Ytterligare betydande cell- och aggregerad förlust förväntas under medieförändringar. Jämfört med automatiserade plattformar ökar hanteringstiden och kontamineringsrisken med hjälp av bänkbioreaktorn, eftersom medelstora byten måste utföras manuellt. Bortsett från bristen på automatisering erbjuder bänkbioreaktorn inte möjligheten att övervaka näringsämnena, och den maximala kapaciteten på 50 ml per rör begränsar protokollets uppskalningspotential. Slutligen är det viktigt att notera att även om NGN2 accelererar neuronalt härstamningsengagemang, förkortas inte varaktigheten av terminal mognad och kräver fortfarande långsiktig kultur under flera veckor. Med tanke på vikten av astrocytiskt stöd för neuronal funktion, bindning och överlevnad 49,50,51, bör samodlingsmetoder övervägas och kan till och med vara nödvändiga för långsiktig odling.
Sammanfattningsvis översattes ett 2D-differentieringsprotokoll framgångsrikt till en 3D-miljö för snabb och reproducerbar generering av iNGN2-neuroner genom att implementera en bänkbioreaktor. Det beskrivna protokollet ger stora mängder av iPSC-härledda neuroner av god kvalitet, vilket kan fungera som utgångspunkt för komplexa modelltester, läkemedelsscreeningar med hög genomströmning och storskaliga toxicitetsanalyser.
The authors have nothing to disclose.
EBiSC2-projektet har fått finansiering från det gemensamma företaget för initiativet för innovativa läkemedel 2 (JU) enligt bidragsavtal nr 821362. Det gemensamma företaget får stöd från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 och EFPIA. Vi tackar Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters och Vanessa M. Nalewaja för deras hjälp med immuncytokemiska analyser och genuttrycksanalyser, samt Heike Arthen för hennes utmärkta tekniska support. Dessutom tackar vi Stephanie Bur för inrättandet av bioreaktorprogrammet. Figur 2A skapades med BioRender.com.
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 11528926 | |
60 mm Nunclon Delta Surface | Nunc | 734-2040 | |
Anti-beta III Tubulin antibody [TU-20] (dilution 1:1,000) | Abcam | ab7751 | |
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 10400745 | |
B-27 Supplement (50x) | Gibco | 11530536 | serum-free Supplement (50x) |
BIONi010-C-13 hiPSC line | European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor | SAMEA103988285 | Bioneer is depositor in EBiSC and owner of the hiPSC line. |
Biorender | Biorender.com | ||
BSA Cell Culture grade | Thermo Fisher Scientific | 12330023 | |
CERO 3D Incubator & Bioreactor | OLS OMNI Life Science | 2800000 | |
CEROtubes Cell culture Tubes 50 mL | OLS OMNI Life Science | 2800005 | |
Citavi 6 | Swiss Academic Software | ||
CryoStor CS10 | Stemcell | 7930 | freezing medium containing 10% DMSO |
Cytofix Fixation Solution | BD Biosciences | 554655 | fixation solution containing 4% paraformaldehyde |
DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN) | Thermo Fisher Scientific | 12333553 | |
Doxycycline hydrochloride (DOX) | Sigma-Aldrich | D3447 | |
DPBS without Calcium and Magnesium (DPBS -/-) | Gibco | 14190250 | |
DPBS with Calcium and Magnesium (DPBS +/+) | Gibco | 11580456 | |
DMEM/F12 (-/-) | Gibco | 21331-020 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | Gibco | 31331-028 | |
EVOS XL Core Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | ||
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21424 | |
GlutaMAX supplement | Gibco | 35050-038 | stabilized L-alanyl-L-glutamine dipeptid |
ImageJ 1.51v | National Institute of Health | ||
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278l | |
Laminin | Merck | L2020 | |
MACSQuant Analyzer | Miltenyi | ||
MAP2 Monoclonal Antibody (dilution 1: 300) | Thermo Fisher Scientific | 13-1500 | |
Matrigel Growth factor reduced, phenol-red free | Corning Life Science | 356231 | basement membrane matrix |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film Kit | Thermo Fisher Scientific | 10095714 | |
mTeSR1 | Stemcell | 85850 | feeder-free iPSC maintenance medium |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | serum-free Supplement based on Bottenstein’s N-1 formulation |
Neurobasal Medium | Gibco | 11570556 | |
Nikon Eclipse TS2 | Nikon Instruments Europe B.V. | ||
NucleoCounter-NC200 | ChemoMetec A/S | ||
Origin 2021 | OriginLab | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 11548876 | |
Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | |
Primer assay TUBB3(Hs00801390_s1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay GUSB (Hs99999908_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay MAP2 (Hs00258900_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay MAPT (Hs00902194_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Primer assay POU5F1 (Hs04260367_gH) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
Poly-L-ornithine 0.01% | Merck | P4957 | |
RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit | Qiagen | 74034 | column-based RNA isolation kit |
RLT Buffer | Qiagen | 79216 | cell lysis buffer |
Sodium Pyruvat (100 mM) | Gibco | 12539059 | |
StemPro Accutase | Gibco | 11599686 | cell dissociation enzyme |
TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX | Thermo Fisher Scientific | 11380912 | qPCR master mix |
Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
TrypLE Select Enzym | Gibco | 12563-011 | Trypsin-EDTA solution |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
Via1-Cassette | ChemoMetec A/S | 941-0012 | |
Wide Bore Filtered Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 10088880 | |
X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES | Thermo Fisher Scientific | 15206343 | |
Y-27632 dihydrochloride, Rho kinase inhibitor (ROCK inhibitor) | Abcam | ab120129 |