Belysning af metabolismen af 2,4-dibromphenol i planter
Summary
Denne protokol beskriver en enkel og effektiv metode til identifikation af 2,4-dibromphenolmetabolitter i planter.
Abstract
Afgrøder kan i vid udstrækning udsættes for organiske forurenende stoffer, da jord er et stort dræn for forurenende stoffer, der kasseres i miljøet. Dette skaber potentiel menneskelig eksponering gennem indtagelse af forurenende akkumulerede fødevarer. Belysning af optagelsen og metabolismen af xenobiotika i afgrøder er afgørende for vurderingen af risikoen for eksponering via kosten hos mennesker. For sådanne forsøg kræver brugen af intakte planter imidlertid langsigtede eksperimenter og komplekse prøveforberedelsesprotokoller, der kan påvirkes af forskellige faktorer. Plant callus kulturer kombineret med højopløsnings massespektrometri (HRMS) kan give en løsning til nøjagtig og tidsbesparende identifikation af metabolitter af xenobiotika i planter, da det kan undgå interferens fra mikrobielt eller svampemikromiljø, forkorte behandlingsvarigheden og forenkle matrixeffekten af intakte planter. 2,4-dibromphenol, et typisk flammehæmmende og hormonforstyrrende stof, blev valgt som modelstof på grund af dets udbredte forekomst i jorden og dets optagelsespotentiale i planter. Heri blev plantecallus genereret fra asepsisfrø og udsat for sterilt 2,4-dibromphenolholdigt dyrkningsmedium. Resultaterne viste, at otte metabolitter af 2,4-dibromphenol blev identificeret i plantens callusvæv efter 120 timers inkubation. Dette indikerer, at 2,4-dibromphenol hurtigt blev metaboliseret i plantens callusvæv. Således er plantekalluskulturplatformen en effektiv metode til at evaluere optagelsen og metabolismen af xenobiotika i planter.
Introduction
Et stigende antal organiske forurenende stoffer er blevet smidt ud i miljøet på grund af menneskeskabte aktiviteter 1,2, og jord betragtes som et stort dræn for disse forurenende stoffer 3,4. De forurenende stoffer i jorden kan optages af planter og potentielt overføres til organismer på højere trofisk niveau langs fødekæder ved direkte at trænge ind i menneskekroppen gennem afgrødeforbrug, hvilket fører til utilsigtet eksponering 5,6. Planter udnytter forskellige veje til at metabolisere xenobiotika til afgiftning7; Det er vigtigt at belyse metabolismen af xenobiotika, da det styrer den faktiske skæbne for forurenende stoffer i planter. Da metabolitterne kan udskilles via blade (til atmosfæren) eller rødderne, giver bestemmelse af metabolitterne i de meget tidlige eksponeringsfaser mulighed for at teste et udvidet antal metabolitter8. Undersøgelser, der bruger intakte planter, kræver imidlertid langsigtede eksperimenter og komplekse prøveforberedelsesprotokoller, der kan påvirkes af forskellige faktorer.
Plant callus kulturer er derfor et godt alternativ til at studere metabolismen af xenobiotika i planta, da de i høj grad kan forkorte behandlingstiden. Disse kulturer udelukker mikrobiel interferens og fotokemisk nedbrydning, forenkler matrixeffekten af intakte planter, standardiserer dyrkningsbetingelserne og kræver mindre eksperimentel indsats. Plant callus kulturer er med succes blevet anvendt som en alternativ tilgang i metaboliske undersøgelser af triclosan9, nonylphenol10 og tebuconazol8. Disse undersøgelser viste, at de metaboliske mønstre i calluskulturer lignede dem i intakte planter. Denne undersøgelse foreslår en metode til effektiv og nøjagtig identifikation af metabolitter af xenobiotika i planter uden komplekse og tidskrævende protokoller. Her bruger vi plantecalluskulturer i kombination med massespektrometri med høj opløsning til analyse af metabolitter med lavintensitetssignaler11,12.
Til dette formål blev callussuspensioner af gulerod (Daucus carota var. sativus) udsat for 100 μg/l 2,4-dibromphenol i 120 timer i en ryster ved 130 o/min og 26 °C. 2,4-dibromphenol blev valgt på grund af dets forstyrrende endokrine aktivitet13 og udbredte forekomst i jord14. Metabolitterne blev ekstraheret og analyseret ved massespektrometri med høj opløsning. Den her foreslåede protokol kan undersøge in planta metabolisme af andre typer organiske forbindelser, der kan ioniseres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol blev udviklet til effektivt at identificere biotransformation af xenobiotika i planter. Det kritiske trin i denne protokol er kulturen af planten callus. Den sværeste del er differentieringen og vedligeholdelsen af planten callus, fordi planten callus let inficeres og udvikles til plantevæv. Derfor er det vigtigt at sikre, at alt anvendt udstyr er autoklaveret, og alle operationer udføres under aseptiske forhold. Differentieringen og vedligeholdelsen af plantens callus skal ske i mørke for at undgå au…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (21976160) og Zhejiang Province Public Welfare Technology Application Research Project (LGF21B070006).
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
References
- Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).
- Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).
- Xu, Y. W., et al. Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil. Chemosphere. 277, 130232 (2021).
- Cai, Q. Y., et al. Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).
- Wang, S. Y., et al. et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).
- Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).
- Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).
- Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).
- Macherius, A., et al. Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment. Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).
- Sun, J. Q., et al. Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation. Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).
- Schymanski, E. L., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).
- Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study. Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).
- Ren, Z., et al. Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China. Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).
- de Wit, C. A. An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).
- Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).
- Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures. Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).
- Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go. Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).
- Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens. Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).
- Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).
- Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).
