Выделение и культивирование стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека, с помощью инновационного безксеногенного метода терапии человека
Summary
Ксеногенные (химические или животного происхождения) продукты, вводимые на этапах подготовки/манипуляции с клеточной терапией, связаны с повышенным риском иммунной реактивности и патогенной передачи у пациентов-хозяев. Здесь описан полный безксеногенный метод выделения и экспансии in vitro стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека.
Abstract
Учитывая растущее влияние терапии стволовыми клетками, были высказаны опасения по поводу биобезопасности в отношении потенциального загрязнения или передачи инфекции из-за введения продуктов животного происхождения во время манипуляций in vitro . Ксеногенные компоненты, такие как коллагеназа или эмбриональная бычья сыворотка, обычно используемые на этапах выделения и расширения клеток, могут быть связаны с потенциальным риском иммунной реактивности или вирусной, бактериальной и прионной инфекции у получающих пациентов. Следуя рекомендациям по надлежащей производственной практике, следует избегать химической диссоциации тканей, в то время как эмбриональная бычья сыворотка (FBS) может быть заменена добавками, не содержащими ксеногенов. Кроме того, для обеспечения безопасности клеточных продуктов важно определение более надежных и воспроизводимых методов. Мы разработали инновационный, полностью свободный от ксеногенов метод выделения и расширения in vitro стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека, без изменения их свойств по сравнению со стандартными протоколами, культивируемыми коллагеназой FBS. Здесь из жировой ткани брюшной полости были выделены стволовые клетки, полученные из жировой ткани человека (hASCs). Образец механически измельчали ножницами/скальпелем, микрорассекали и механически диспергировали в 10-сантиметровой чашке Петри и готовили с разрезами скальпелем для облегчения прикрепления фрагментов ткани и миграции hASC. После этапов промывки hASC были выбраны из-за их пластической адгезии без ферментативного сбраживания. Выделенные hASC культивировали со средой, дополненной 5% лизатом тромбоцитов человека, не содержащим гепарина, и отделяли с заменителем трипсина, не содержащим животных. В соответствии с указаниями надлежащей производственной практики (GMP) по производству клеточных продуктов, предназначенных для терапии человека, антибиотики не использовались ни в одной питательной среде.
Introduction
В последние десятилетия растущий спрос на инновационные терапевтические методы лечения привел к значительным усилиям и инвестициям в ресурсы в области трансляционной медицины1. Клеточные продукты связаны с рисками, определяемыми клеточным источником, производственным процессом (выделение, экспансия или генетическая модификация) и неклеточными добавками (ферменты, факторы роста, культуральные добавки и антибиотики), и эти факторы риска зависят от конкретных терапевтических показаний. На качество, безопасность и эффективность конечного продукта могут оказывать глубокое влияние вышеуказанные элементы2. Терапия стволовыми клетками требует соблюдения принципов биобезопасности; Потенциальные риски патогенной передачи с продуктами животного происхождения в культуре клеток могут быть проблематичными, и тщательное тестирование любого продукта, введенного в производство, имеет важное значение3.
Традиционный метод выделения стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека (hASCs), включает ферментативное расщепление, выполняемое коллагеназой, с последующим промывом этапов центрифугирования4. В то время как ферментативная изоляция, как правило, считается более эффективной, чем другие механические методы, с точки зрения выхода клеток и жизнеспособности, используемые компоненты животного происхождения, такие как коллагеназа, считаются более чем минимально манипулируемыми Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. Это означает, что существует значительно повышенный риск иммунных реакций или передачи заболевания, что ограничивает перевод терапии hASC в клинические условия 5,6.
Пищеварение на основе трипсина является еще одним ферментативным протоколом для выделения ИСС. Были описаны различные методы с небольшими изменениями с точки зрения концентрации трипсина, скорости центрифугирования и времени инкубации. К сожалению, этот метод недостаточно хорошо описан, и в литературе отсутствует сравнение, особенно с протоколами механической изоляции7. Однако с точки зрения переводимости подхода трипсин имеет те же недостатки, что и коллагеназа.
Альтернативные методы выделения для получения ИСС, основанные на механических силах и без добавления ферментов, включают высокоскоростное центрифугирование (800 x g или 1,280 x g, 15 мин) фрагментов жировой ткани. Затем гранулы инкубируют с буфером лизиса эритроцитов (5 мин), после чего следует еще одна стадия центрифугирования при 600 x g перед ресуспендированием в питательной среде. Несмотря на большее количество клеток, выделенных в первые дни по сравнению с методами эксплантата, предыдущее исследование показало более низкую или отсутствующую пролиферацию после второй недели культивирования8.
Кроме того, дальнейшие манипуляции с ксеногенной добавленной средой, такой как эмбриональная бычья сыворотка (FBS), которая используется в качестве добавки фактора роста для клеточной культуры, связаны с повышенным риском иммунной реактивности и воздействия вирусных, бактериальных или прионных инфекций пациента-хозяина 9,10. Иммунные реакции и развитие крапивницы уже были описаны у лиц, получавших несколько доз мезенхимальных стволовых клеток, продуцируемых с помощью FBS11. Кроме того, FBS подвержен вариабельности от партии к партии, что может повлиять на качество конечного продукта12.
В соответствии с руководящими принципами надлежащей производственной практики (GMP) следует избегать ферментативной диссоциации тканей и заменять FBS добавками, не содержащими ксеногенов. Эти шаги вместе с более надежными и воспроизводимыми протоколами необходимы для поддержки применения клеточной терапии 3,13.
В этом контексте лизат тромбоцитов человека (hPL) был предложен в качестве замены FBS, поскольку он представляет собой бесклеточную, содержащую белок, обогащенную фактором роста добавку, и ранее он был представлен среди продуктов на клеточной основе клинического класса в качестве добавки питательной среды для культивирования и размножения клеток in vitro 14,15. Поскольку hPL является продуктом человеческого происхождения, он часто используется в качестве заменителя FBS во время культивирования in vitro hASCs, предназначенных для клинического применения, тем самым уменьшая проблемы, связанные с иммунологическими реакциями и инфекциями, связанными с переводимостью FBS15,16.
Несмотря на более высокие производственные затраты, уже было продемонстрировано, что по сравнению с FBS hPL поддерживает жизнеспособность клеток для многих типов клеток, увеличивает пролиферацию, задерживает старение, обеспечивает стабильность генома и сохраняет клеточный иммунофенотип даже в поздних клеточных пассажах; Все эти элементы способствуют переходу на эту культуру Дополнение11.
Целью данной работы была разработка стандартизированного протокола выделения и культивирования hASC полным безживотным методом, без изменения физиологии клеток и свойств стволовости по сравнению с классическими hASC, культивируемыми FBS (рис. 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Стволовые клетки, полученные из жировой ткани, привлекли интерес трансляционных исследований в последнее десятилетие из-за их изобилия, быстрых и доступных методов выделения, высокой скорости пролиферации in vitro/in vivo и свойств стволовости/дифференцировки18,19,20</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
У авторов нет благодарностей.
Materials
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | – | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | – | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
References
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).
- Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
- Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
- Fadel, L., et al. Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep. Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Lalu, M. M., et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials. PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).
- Escobar, C. H., Chaparro, O. Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).
- Vaidya, V., et al. Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum. Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).
- Kyllönen, L., et al. Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17 (2013).
- Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion. Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Cowper, M., et al. Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
- Kim, N., et al. Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice. Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).
- Palombella, S., et al. Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model. Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).
- Perez-Ilzarbe, M., et al. Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy. Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
- Becherucci, V., et al. Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124 (2018).
- Blande, I. S., et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).
- Castegnaro, S., et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).
- Palombella, S., et al. Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142 (2022).
- Palombella, S., et al. Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432 (2020).
- Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use. International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007 (2015).
