इन विट्रो प्रयोगों के आधार पर, इस अध्ययन ने माइटोफैगी को प्रभावित करके कार्डियोमायोसाइट्स के ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति की मरम्मत में क्रोसेटिन के तंत्र का खुलासा किया, जिसमें पिंक 1 / पार्किन सिग्नलिंग मार्ग एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
इस अध्ययन का उद्देश्य इन विट्रो प्रयोगों के माध्यम से एच 2 ओ 2-मध्यस्थता एच 9सी2 मायोकार्डियल कोशिकाओं पर क्रोसेटिन के ऑक्सीडेटिव तनाव-सुरक्षात्मक प्रभाव का पता लगाना था, और आगे यह पता लगाना था कि क्या इसका तंत्र माइटोफैगी के प्रभाव से संबंधित है। इस अध्ययन का उद्देश्य कार्डियोमायोसाइट्स में ऑक्सीडेटिव तनाव पर कुसुम एसिड के चिकित्सीय प्रभाव को प्रदर्शित करना और यह पता लगाना है कि क्या इसका तंत्र माइटोफैगी के प्रभाव से संबंधित है। यहां, एक एच 2 ओ2-आधारितऑक्सीडेटिव तनाव मॉडल का निर्माण किया गया था और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच), क्रिएटिन काइनेज (सीके), मालोंडिएल्डिहाइड (एमडीए), सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी), कैटलेस (कैट), और ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज (जीएसएच पीएक्स) के स्तर का पता लगाकर कार्डियोमायोसाइट्स के ऑक्सीडेटिव तनाव की चोट की डिग्री का आकलन किया गया था। माइटोकॉन्ड्रियल क्षति और एपोप्टोसिस का आकलन करने के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) -फ्लोरोसेंट डाई डीसीएफएच-डीए, जेसी -1 डाई और ट्यूनल डाई का पता लगाने के लिए नियोजित किया गया था। ऑटोफैजिक फ्लक्स को एड-एमचेरी-जीएफपी-एलसी 3 बी एडेनोवायरस को स्थानांतरित करके मापा गया था। माइटोफैगी से संबंधित प्रोटीन का पता तब पश्चिमी सोख्ता और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से लगाया गया था। हालांकि, क्रोसेटिन (0.1-10 μM) सेल व्यवहार्यता में काफी सुधार कर सकता है और एच 2 ओ2के कारण एपोप्टोसिस और ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति को कम कर सकताहै। अत्यधिक ऑटोफैजिक सक्रियण वाली कोशिकाओं में, क्रोसेटिन ऑटोफैगी प्रवाह और माइटोफैगी से संबंधित प्रोटीन पिंक 1 और पार्किन की अभिव्यक्ति को भी कम कर सकता है, और पार्किन के माइटोकॉन्ड्रिया में स्थानांतरण को उलट सकता है। क्रोसेटिन एच 2 ओ 2-मध्यस्थता ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति और एच 9 सी2कोशिकाओं के एपोप्टोसिस को कम कर सकता है, और इसका तंत्र माइटोफैगी से निकटता से संबंधित था।
तीव्र मायोकार्डियल रोधगलन (एएमआई) एक जानलेवा मायोकार्डियल नेक्रोसिस है जो गंभीर और लगातार इस्किमिया और कोरोनरी धमनियों में हाइपोक्सिया के कारण होता है। पर्क्यूटेनियस कोरोनरी इंटरवेंशन (पीसीआई) एएमआई के लिए पहली पंक्ति की चिकित्सीय रणनीतियों में से एक है, और आमतौर पर कार्डियोमायोसाइट्स को इस्केमिक क्षति 3,4 से बचाता है। डिस्टल मायोकार्डियम में रक्त और ऑक्सीजन की आपूर्ति की कमी होगी यदि एएमआई के बाद तुरंत और प्रभावी ढंग से इलाज नहीं किया जाता है, जिससे इस्केमिक नेक्रोसिस और आगे कार्डियोवैस्कुलर जटिलताएं 5,6 हो जाती हैं। कार्डियोमायोसाइट्स रिकवरी को बढ़ावा देना और पीसीआई सर्जिकल अवसर से चूकने के बाद अपरिवर्तनीय मायोकार्डियल क्षति को कम करना एक शोध हॉटस्पॉट रहा है। एएमआई के बाद, कार्डियोमायोसाइट्स इस्किमिया और हाइपोक्सिया की स्थिति में होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन का निषेध, एनएडी + से एनएडीपीएच में कमी और एकल इलेक्ट्रॉन कमीमें वृद्धि होती है। नतीजतन, ऑक्सीजन की अपूर्ण कमी प्रतिक्रिया प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की अधिकता उत्पन्न करती है और अंततः कार्डियोमायोसाइट्सको ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति की ओर ले जाती है। आरओएस का अत्यधिक संचय लिपिड पेरोक्सीडेशन को ट्रिगर करता है, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली की संरचना और कार्य को और बाधित करता है। परिणाम माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण छिद्रों का निरंतर उद्घाटन और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में कमी है, जो एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस को प्रेरित करता है।
एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम (एसीई) इनहिबिटर, एंजियोटेंसिन-रिसेप्टर ब्लॉकर्स (एआरबी), एएमआई में β-एड्रेनोसेप्टर्स, एल्डोस्टेरोन विरोधी और अन्य मानक दवाओं के अवरोधक मायोकार्डियल रोधगलन के बाद हृदय समारोह को बढ़ाने में मदद कर सकते हैं और घातक घटनाओं की घटना को रोक सकते हैं, जैसे कि अतालता और बाएं वेंट्रिकुलर रीमॉडेलिंग9। हालांकि, पोस्टरोधगलन अस्तित्व और रोग का निदान इन्फ्रैक्ट आकार से बहुत प्रभावित होता है, और कार्डियोमायोसाइट्स एपोप्टोसिस10,11 को कम करने के लिए संतोषजनक परिणाम प्राप्त नहीं किए गए हैं। इस प्रकार, मायोकार्डियल रोधगलन के बाद कार्डियोमायोसाइट्स वसूली को बढ़ावा देने के लिए दवाओं का विकास एक जरूरी मुद्दा बन गया है।
पारंपरिक चिकित्सा कई वर्षों से आधुनिक दवा अनुसंधान के लिए प्रेरणा का स्रोत रही है12,13,14,15। पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) का एएमआई के उपचार में एक लंबा इतिहास है, और हाल के वर्षों में यादृच्छिक नियंत्रण परीक्षणों की एक श्रृंखला ने पुष्टि की है कि टीसीएम वास्तवमें रोगियों के पूर्वानुमान में सुधार कर सकता है। टीसीएम सिद्धांत के अनुसार, एएमआई रक्त ठहराव18,19 के कारण होता है, इसलिए रक्त परिसंचरण को बढ़ावा देने के लिए दवाओं का उपयोग आमतौर पर तीव्र चरण20 में एएमआई के उपचार के लिए किया जाता है। उनमें से, केसर को रक्त सक्रियण और ठहराव पर एक शक्तिशाली प्रभाव माना जाता है, और अक्सर एएमआई के तीव्र उपचार में उपयोग किया जाता है। क्रोसेटिन, केसर का एक प्रमुख घटक, कार्डियोमायोसाइट्स21 की रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।
इस अध्ययन में, एच 9 सी 2 मायोकार्डियल कोशिकाओं को एच 2ओ2 द्वारा मायोकार्डियल इस्किमिया / रीपरफ्यूजन का अनुकरण करने के लिए प्रेरित किया गया था, जो एएमआई की कार्डियोमायोसाइट चोट का कारण बनता है, और क्रोसेटिन का उपयोग ऑक्सीडेटिव तनाव-प्रेरित मायोकार्डियल चोट के खिलाफ इसके सुरक्षात्मक प्रभाव की जांच के लिए एक हस्तक्षेप के रूप में किया गया था। कार्डियोमायोसाइट्स की रक्षा करने वाले क्रोसेटिन के तंत्र को माइटोफैगी के माध्यम से आगे खोजा गया था। इससे भी महत्वपूर्ण बात, यह लेख माइटोफैगी के अध्ययन के लिए तकनीकी दृष्टिकोण के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है और पूरी प्रयोगात्मक प्रक्रिया का विस्तार से वर्णन करता है।
उन्नत प्रौद्योगिकी के माध्यम से प्राकृतिक दवाओं के जटिल यौगिकों से प्रभावी अवयवों की खोज टीसीएम अनुसंधानका एक हॉटस्पॉट रहा है, और सत्यापन के बाद भविष्य की दवा के विकास के लिए प्रयोगशाला साक्…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को बीजिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 7202119) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 82274380) द्वारा समर्थित किया गया था।
0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
DMSO | Solarbio | D8371 | |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
Methanol | Aladdin | A2114057 | |
MTS assay | Promega | G3581 | |
Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
Polybrene | Beyotime | C0351 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
Tween-20 | Solarbio | T8220 |