توليد كرويات الورم 3D لدراسات تقييم المخدرات
Summary
توضح هذه المقالة طريقة موحدة لبناء كرويات الورم ثلاثية الأبعاد. كما تم وصف استراتيجية للمراقبة الكروية وتحليل التعلم العميق القائم على الصور باستخدام نظام التصوير الآلي.
Abstract
في العقود الأخيرة ، بالإضافة إلى الخلايا المستزرعة أحادية الطبقة ، تم تطوير كرويات الورم ثلاثية الأبعاد كأداة قوية محتملة لتقييم الأدوية المضادة للسرطان. ومع ذلك ، فإن طرق الاستزراع التقليدية تفتقر إلى القدرة على التعامل مع كرويات الورم بطريقة متجانسة على المستوى ثلاثي الأبعاد. لمعالجة هذا القيد ، في هذه الورقة ، نقدم طريقة مريحة وفعالة لبناء كرويات الورم متوسطة الحجم. بالإضافة إلى ذلك ، نصف طريقة للتحليل القائم على الصور باستخدام برنامج التحليل القائم على الذكاء الاصطناعي الذي يمكنه مسح اللوحة بأكملها والحصول على بيانات عن كرويات ثلاثية الأبعاد. تمت دراسة العديد من المعلمات. باستخدام طريقة قياسية لبناء كروي الورم ونظام تصوير وتحليل عالي الإنتاجية ، يمكن زيادة فعالية ودقة اختبارات الأدوية التي يتم إجراؤها على كرويات ثلاثية الأبعاد بشكل كبير.
Introduction
السرطان هو أحد الأمراض التي يخشاها البشر ، لأسباب ليس أقلها ارتفاع معدل الوفيات1. في السنوات الأخيرة ، زادت إمكانية علاج السرطان حيث تم إدخال علاجات جديدة2،3،4،5. تستخدم النماذج ثنائية الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) في المختبر لدراسة السرطان في بيئة معملية. ومع ذلك ، لا يمكن لنماذج 2D تقييم جميع المعلمات المهمة التي تشير إلى حساسية مضادة للأورام على الفور وبدقة ؛ لذلك ، فشلوا في التمثيل الكامل للتفاعلات في الجسم الحي في اختبار العلاج الدوائي6.
منذ عام 2020 ، تم تعزيز سوق الثقافة العالمية ثلاثية الأبعاد (3D) بشكل كبير. وفقا لأحد التقارير الصادرة عن NASDAQ OMX ، ستتجاوز القيمة العالمية لسوق زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد 2.7 مليار دولار أمريكي بحلول نهاية عام 2025. بالمقارنة مع طرق الثقافة 2D ، فإن زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد تعرض خصائص مفيدة ، والتي يمكن تحسينها ليس فقط للانتشار والتمايز ولكن أيضا للبقاء على المدى الطويل 7,8. بهذه الوسائل ، يمكن محاكاة البيئات الدقيقة الخلوية في الجسم الحي للحصول على توصيف أكثر دقة للورم ، وكذلك التنميط الأيضي ، بحيث يمكن فهم التغيرات الجينومية والبروتينية بشكل أفضل. ونتيجة لذلك ، يجب الآن تضمين أنظمة اختبار 3D في عمليات تطوير الأدوية السائدة ، خاصة تلك التي تركز على فحص وتقييم الأدوية الجديدة المضادة للأورام. تمتلك النموات ثلاثية الأبعاد لخطوط الخلايا الراسخة الخالدة أو مزارع الخلايا الأولية في الهياكل الكروية في الجسم الحي سمات الأورام مثل نقص الأكسجة واختراق الأدوية ، بالإضافة إلى تفاعل الخلايا والاستجابة والمقاومة ، ويمكن اعتبارها نموذجا صارما وتمثيليا لأداء فحص المخدرات في المختبر 9،10،11.
ومع ذلك ، فإن نماذج ثقافة 3D هذه تعاني أيضا من العديد من المشكلات التي قد تستغرق بعض الوقت لحلها. يمكن تشكيل كرويات الخلية باستخدام هذه البروتوكولات ، لكنها تختلف في تفاصيل معينة ، مثل وقت المزرعة أو تضمين المواد الهلامية12 ، لذلك لا يمكن التحكم في هذه الكرويات الخلوية المبنية بشكل جيد في نطاق حجم محدود. قد يؤثر حجم الأجسام الكروية على اتساق اختبار الجدوى وتحليل التصوير. تختلف أيضا البيئات الدقيقة للنمو وعوامل النمو ، مما قد يؤدي إلى أشكال مختلفة بسبب الاختلافات في التمايز بين الخلايا13. هناك الآن حاجة واضحة لطريقة قياسية وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة لبناء جميع أنواع الأورام بأحجام خاضعة للرقابة.
من منظور آخر ، على الرغم من تطوير المقايسات المتجانسة وأساليب التصوير عالية المحتوى لتقييم التشكل والجدوى ومعدل النمو ، إلا أن الفحص عالي الإنتاجية لنماذج 3D لا يزال يمثل تحديا لأسباب مختلفة تم الإبلاغ عنها في الأدبيات ، مثل عدم التوحيد في موضع وحجم ومورفولوجيا كرويات الورم14،15،16.
في البروتوكول المقدم هنا ، ندرج كل خطوة في بناء كرويات الورم 3D ونصف طريقة لمراقبة وتحليل كروية باستخدام نظام تصوير عالي الإنتاجية وعالي المحتوى يتضمن التركيز التلقائي والتصوير التلقائي والتحليل ، من بين خصائص مفيدة أخرى. نظهر كيف يمكن لهذه الطريقة إنتاج كرويات الورم 3D ذات الحجم الموحد المناسبة للتصوير عالي الإنتاجية. تظهر هذه الكرويات أيضا حساسية عالية لعلاج أدوية السرطان ، ويمكن مراقبة التغيرات المورفولوجية في الكائنات الكروية باستخدام التصوير عالي المحتوى. باختصار ، نظهر متانة هذه المنهجية كوسيلة لتوليد تركيبات الورم 3D لأغراض تقييم المخدرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تلعب البيئة المكروية دورا مهما في نمو الورم. قد يؤثر على توفير المصفوفات خارج الخلية ، وتدرجات الأكسجين ، والتغذية ، والتفاعل الميكانيكي ، وبالتالي يؤثر على التعبير الجيني ، ومسارات الإشارة ، والعديد من وظائف الخلايا السرطانية19،20،21. في ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جميع أعضاء مختبراتنا على مدخلاتهم واقتراحاتهم الهامة. تم دعم هذا البحث من قبل المشروع الرئيسي للجنة جيانغسو للصحة (K2019030). تم إجراء التصور من قبل C.W. و Z.C. ، وتم تنفيذ المنهجية بواسطة W.H. و M.L. ، وتم إجراء التحقيق بواسطة W.H. و M.L. ، وتم تنفيذ تنظيم البيانات بواسطة W.H. ، Z.Z. ، S.X. ، و M.L. ، وتم تنفيذ إعداد المسودة الأصلية بواسطة Z.Z. ، J.Z. ، S.X. ، W.H. ، و X.L. ، تم إجراء المراجعة والتحرير بواسطة Z.C. ، وتم تنفيذ إدارة المشروع بواسطة C.W. و Z.C. ، وتم إجراء الاستحواذ على التمويل بواسطة C.W. قرأ جميع المؤلفين النسخة المنشورة من المخطوطة ووافقوا عليها.
Materials
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Microscope and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
References
- Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
- Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).
- Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy. FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).
- Shokooohi, A., et al. Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world. Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).
- Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 116 (2021).
- Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells. Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).
- Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species. FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. 3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments. Scientific Reports. 10, 1653 (2020).
- Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer. Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
- Carragher, N., et al. Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models. Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).
- Huang, Y., et al. Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).
- Yazdanfar, S., et al. Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy. Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).
- Chen, Z., et al. Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition. Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).
- Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).
- Anastasiou, D., et al. Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape. British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).
- Zhou, H., et al. Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis. Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).
- Zhu, G. G., et al. Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance. Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).
- Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy. Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).
- Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
- Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
