生成用于药物评估研究的 3D 肿瘤微球
Summary
本文演示了一种构建三维肿瘤球体的标准化方法。还描述了使用自动成像系统进行球体观察和基于图像的深度学习分析的策略。
Abstract
近几十年来，除了单层培养细胞外，三维肿瘤球状体已被开发为评估抗癌药物的潜在强大工具。然而，传统的培养方法缺乏在三维水平上以均匀方式操纵肿瘤球状体的能力。为了解决这一局限性，在本文中，我们提出了一种构建平均大小的肿瘤球体的方便有效的方法。此外，我们描述了一种使用基于人工智能的分析软件进行基于图像的分析方法，该软件可以扫描整个板并获得三维球体的数据。研究了几个参数。通过使用肿瘤球体构建的标准方法和高通量成像和分析系统，可以显着提高对三维球状体进行的药物测试的有效性和准确性。
Introduction
癌症是人类最害怕的疾病之一，尤其是因为它的高死亡率1。近年来，随着新疗法的引入，治疗癌症的可能性有所增加2,3,4,5。二维（2D）和三维（3D）体外模型用于在实验室环境中研究癌症。然而，2D模型不能立即准确地评估指示抗肿瘤敏感性的所有重要参数;因此，它们无法完全代表药物治疗测试中的体内相互作用6。
自2020年以来，全球三维（3D）文化市场得到了极大的推动。根据纳斯达克OMX的一份报告，到2025年底，3D细胞培养市场的全球价值将超过27亿美元。与2D培养方法相比，3D细胞培养表现出有利的特性，不仅可以优化增殖和分化，还可以优化长期存活7,8。通过这种方法，可以模拟体内细胞微环境以获得更准确的肿瘤表征，以及代谢分析，从而可以更好地了解基因组和蛋白质的改变。因此，3D测试系统现在应该被纳入主流药物开发业务，特别是那些专注于筛选和评估新型抗肿瘤药物的操作。永生化已建立的细胞系或原代细胞培养物在球状结构中的三维生长具有肿瘤的缺氧和药物渗透等体内特征，以及细胞相互作用、反应和耐药性，可被视为进行体外药物筛选的严格和代表性模型9,10,11。
然而，这些3D文化模型也存在一些可能需要一些时间才能解决的问题。可以使用这些方案形成细胞球状体，但它们在某些细节上有所不同，例如培养时间或包埋凝胶12，因此这些构建的细胞球体不能在有限的尺寸范围内得到很好的控制。微球的大小可能会影响活力测试和成像分析的一致性。生长微环境和生长因子也不同，由于细胞间分化的差异，可能导致不同的形态13。现在显然需要一种标准、简单且具有成本效益的方法来构建具有受控大小的所有类型的肿瘤。
从另一个角度来看，尽管已经开发了均质测定和高内涵成像方法来评估形态、活力和生长速率，但由于文献中报道的各种原因，例如肿瘤球体的位置、大小和形态缺乏均匀性，3D 模型的高通量筛选仍然是一个挑战14,15,16。
在这里介绍的协议中，我们列出了构建3D肿瘤微球的每个步骤，并描述了一种使用高通量，高内涵成像系统的球状体观察和分析方法，该系统涉及自动聚焦，自动成像和分析，以及其他有利特征。我们展示了这种方法如何产生适用于高通量成像的均匀大小的3D肿瘤球体。这些微球还表现出对癌症药物治疗的高敏感性，并且可以使用高内涵成像监测微球的形态变化。总之，我们证明了这种方法作为生成用于药物评估目的的3D肿瘤构建体的手段的稳健性。
Protocol
Representative Results
Discussion
微环境在肿瘤生长中起着重要作用。它可能影响细胞外基质、氧梯度、营养和机械相互作用的提供，从而影响肿瘤细胞的基因表达、信号通路和许多功能19,20,21。在许多情况下，2D细胞不会产生这种效果，甚至不会产生相反的效果，从而影响药物治疗的评估。然而，3D模型的出现解决了这个问题。例如，我们使用3D方法完成了对A…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢实验室的所有成员的重要意见和建议。本研究得到了江苏省卫生健康委员会重点项目（K2019030）的支持。概念化由C.W.和Z.C.进行，方法由W.H.和M.L.执行，调查由W.H.和M.L.执行，数据管理由W.H.，Z.Z.，S.X.和M.L.执行，原始草稿准备由Z.Z.，J.Z.，S.X.，W.H.执行， 和X.L.，审查和编辑由Z.C.执行，项目管理由C.W.和Z.C.执行，资金获取由C.W.进行。所有作者均已阅读并同意该手稿的已出版版本。
Materials
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Microscope and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
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