दवा मूल्यांकन अध्ययन के लिए 3 डी ट्यूमर स्फेरॉइड का उत्पादन
Summary
यह लेख त्रि-आयामी ट्यूमर स्फेरॉइड के निर्माण के लिए एक मानकीकृत विधि प्रदर्शित करता है। एक स्वचालित इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके स्फेरॉइड अवलोकन और छवि-आधारित डीप-लर्निंग विश्लेषण के लिए एक रणनीति भी वर्णित है।
Abstract
हाल के दशकों में, मोनोलेयर-सुसंस्कृत कोशिकाओं के अलावा, तीन-आयामी ट्यूमर स्फेरॉइड को एंटीकैंसर दवाओं के मूल्यांकन के लिए एक संभावित शक्तिशाली उपकरण के रूप में विकसित किया गया है। हालांकि, पारंपरिक संस्कृति विधियों में तीन-आयामी स्तर पर एक सजातीय तरीके से ट्यूमर स्फेरॉइड में हेरफेर करने की क्षमता की कमी है। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, इस पेपर में, हम औसत आकार के ट्यूमर स्फेरॉइड के निर्माण का एक सुविधाजनक और प्रभावी तरीका प्रस्तुत करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम कृत्रिम बुद्धि-आधारित विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि-आधारित विश्लेषण की एक विधि का वर्णन करते हैं जो पूरी प्लेट को स्कैन कर सकता है और त्रि-आयामी स्फेरॉइड पर डेटा प्राप्त कर सकता है। कई मापदंडों का अध्ययन किया गया। ट्यूमर स्फेरॉइड निर्माण की एक मानक विधि और एक उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग और विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके, त्रि-आयामी स्फेरॉइड पर किए गए दवा परीक्षणों की प्रभावशीलता और सटीकता को नाटकीय रूप से बढ़ाया जा सकता है।
Introduction
कैंसर मनुष्यों द्वारा सबसे अधिक भयभीत बीमारियों में से एक है, कम से कम इसकी उच्च मृत्यु दरके कारण नहीं। हाल के वर्षों में, कैंसर के इलाज की संभावना बढ़ गई है क्योंकि नए उपचार 2,3,4,5 पेश किए गए हैं। प्रयोगशाला सेटिंग में कैंसर का अध्ययन करने के लिए दो-आयामी (2 डी) और तीन-आयामी (3 डी) इन विट्रो मॉडल का उपयोग किया जाता है। हालांकि, 2 डी मॉडल तुरंत और सटीक रूप से उन सभी महत्वपूर्ण मापदंडों का आकलन नहीं कर सकते हैं जो एंटीट्यूमर संवेदनशीलता को इंगित करते हैं; इसलिए, वे ड्रग थेरेपी परीक्षण6 में विवो इंटरैक्शन में पूरी तरह से प्रतिनिधित्व करने में विफल रहते हैं।
2020 के बाद से, वैश्विक त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति बाजार को बहुत बढ़ावा दिया गया है। NASDAQ OMX की एक रिपोर्ट के अनुसार, 3D सेल कल्चर बाजार का वैश्विक मूल्य 2025 के अंत तक USD 2.7 बिलियन से अधिक हो जाएगा। 2 डी संस्कृति विधियों की तुलना में, 3 डी सेल संवर्धन लाभप्रद गुणों को प्रदर्शित करता है, जिसे न केवल प्रसार और भेदभाव के लिए बल्किदीर्घकालिक अस्तित्व के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। इस तरह के साधनों से, विवो सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट में अधिक सटीक ट्यूमर लक्षण वर्णन, साथ ही चयापचय प्रोफाइलिंग प्राप्त करने के लिए अनुकरण किया जा सकता है, ताकि जीनोमिक और प्रोटीन परिवर्तनों को बेहतर ढंग से समझा जा सके। इसके कारण, 3 डी परीक्षण प्रणालियों को अब मुख्यधारा के दवा विकास कार्यों में शामिल किया जाना चाहिए, विशेष रूप से उन लोगों के साथ जो नोवेल एंटीट्यूमर दवाओं की स्क्रीनिंग और मूल्यांकन पर ध्यान केंद्रित करते हैं। स्फेरॉइड संरचनाओं में अमर स्थापित सेल लाइनों या प्राथमिक सेल संस्कृतियों के त्रि-आयामी विकास में हाइपोक्सिया और दवा प्रवेश जैसे ट्यूमर की विवो विशेषताएं होती हैं, साथ ही सेल इंटरैक्शन, प्रतिक्रिया और प्रतिरोध, और इन विट्रो ड्रग स्क्रीनिंग 9,10,11 करने के लिए एक कठोर और प्रतिनिधि मॉडल के रूप में माना जा सकता है।
हालांकि, ये 3 डी संस्कृति मॉडल भी कई समस्याओं से पीड़ित हैं जिन्हें हल करने में कुछ समय लग सकता है। इन प्रोटोकॉल का उपयोग करके सेल स्फेरॉइड का गठन किया जा सकता है, लेकिन वे कुछ विवरणों में भिन्न होते हैं, जैसे कि कल्चर टाइम या जैल12 एम्बेड करना, इसलिए इन निर्मित सेल स्फेरॉइड को प्रतिबंधित आकार सीमा के तहत अच्छी तरह से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। स्फेरॉइड का आकार व्यवहार्यता परीक्षण और इमेजिंग विश्लेषण की स्थिरता को प्रभावित कर सकता है। विकास माइक्रोएन्वायरमेंट और विकास कारक भी भिन्न होते हैं,जिससे कोशिकाओं के बीच भेदभाव में अंतर के कारण विभिन्न आकृति विज्ञान हो सकते हैं। अब नियंत्रित आकार के साथ सभी प्रकार के ट्यूमर के निर्माण के लिए एक मानक, सरल और लागत प्रभावी विधि की स्पष्ट आवश्यकता है।
एक अन्य परिप्रेक्ष्य से, हालांकि आकृति विज्ञान, व्यवहार्यता और विकास दर का मूल्यांकन करने के लिए सजातीय परख और उच्च-सामग्री इमेजिंग दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, 3 डी मॉडल की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग साहित्य में रिपोर्ट किए गए विभिन्न कारणों के लिए एक चुनौती बनी हुई है, जैसे कि ट्यूमर स्फेरॉइड14,15,16 की स्थिति, आकार और आकृति विज्ञान में एकरूपता की कमी।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम 3 डी ट्यूमर स्फेरॉइड के निर्माण में प्रत्येक चरण को सूचीबद्ध करते हैं और उच्च-थ्रूपुट, उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके स्फेरॉइड अवलोकन और विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं जिसमें अन्य लाभप्रद विशेषताओं के बीच ऑटो-फोकस, ऑटो-इमेजिंग और विश्लेषण शामिल है। हम दिखाते हैं कि यह विधि समान आकार के 3 डी ट्यूमर स्फेरॉइड का उत्पादन कैसे कर सकती है जो उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं। ये स्फेरॉइड कैंसर की दवा के उपचार के लिए एक उच्च संवेदनशीलता भी प्रदर्शित करते हैं, और उच्च सामग्री इमेजिंग का उपयोग करके स्फेरॉइड में रूपात्मक परिवर्तनों की निगरानी की जा सकती है। सारांश में, हम दवा मूल्यांकन उद्देश्यों के लिए 3 डी ट्यूमर निर्माण उत्पन्न करने के साधन के रूप में इस पद्धति की मजबूती का प्रदर्शन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
माइक्रोएन्वायरमेंट ट्यूमर के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह बाह्य मैट्रिक्स, ऑक्सीजन ग्रेडिएंट्स, पोषण और यांत्रिक बातचीत के प्रावधान को प्रभावित कर सकता है और इस प्रकार, जीन अभिव्यक्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपनी प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों को उनके महत्वपूर्ण इनपुट और सुझावों के लिए धन्यवाद देते हैं। इस शोध को जियांग्सू कमीशन ऑफ हेल्थ (K2019030) की प्रमुख परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था। अवधारणा सीडब्ल्यू और जेडसी द्वारा आयोजित की गई थी, कार्यप्रणाली डब्ल्यूएच और एमएल द्वारा की गई थी, जांच डब्ल्यूएच और एमएल द्वारा की गई थी, डेटा क्यूरेशन डब्ल्यूएच, जेडजेड, एसएक्स और एमएल द्वारा किया गया था, मूल मसौदा तैयारी जेडजेड, जेजेड, एसएक्स, डब्ल्यूएच द्वारा की गई थी। और एक्स.एल., समीक्षा और संपादन जेडसी द्वारा किया गया था, परियोजना प्रशासन सीडब्ल्यू और जेडसी द्वारा किया गया था, और फंडिंग अधिग्रहण सीडब्ल्यू द्वारा आयोजित किया गया था। सभी लेखकों ने पांडुलिपि के प्रकाशित संस्करण को पढ़ा और सहमति व्यक्त की है।
Materials
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Microscope and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
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