医薬品評価研究のための3D腫瘍スフェロイドの作製
Summary
この記事では、3次元腫瘍スフェロイドを構築するための標準化された方法を示します。また、自動イメージングシステムを用いたスフェロイド観察と画像ベースの深層学習解析の戦略についても説明します。
Abstract
ここ数十年で、単層培養細胞に加えて、抗がん剤を評価するための潜在的に強力なツールとして、3次元腫瘍スフェロイドが開発されてきました。しかし、従来の培養方法では、腫瘍スフェロイドを三次元レベルで均質に操作する能力が欠けていました。この制限に対処するために、本論文では、平均的なサイズの腫瘍スフェロイドを構築するための便利で効果的な方法を提示します。さらに、プレート全体をスキャンして3次元回転楕円体のデータを取得できる人工知能ベースの解析ソフトウェアを使用した画像ベースの解析方法についても説明します。いくつかのパラメータが研究された。腫瘍スフェロイド構築の標準的な方法とハイスループットイメージングおよび解析システムを使用することにより、3次元スフェロイドで実行される薬物検査の有効性と精度を劇的に向上させることができます。
Introduction
癌は、特に死亡率が高いため、人間が最も恐れている病気の1つです1。近年、新しい治療法が導入されるにつれて、癌を治療する可能性が高まっています2,3,4,5。2次元(2D)および3次元(3D)in vitroモデルは、実験室環境で癌を研究するために使用されます。ただし、2Dモデルは、抗腫瘍感受性を示すすべての重要なパラメーターを即座に正確に評価することはできません。したがって、それらは薬物療法試験におけるin vivo相互作用を完全に表すことができない6。
2020年以降、世界の3次元(3D)培養市場は大幅に拡大しています。NASDAQ OMXのあるレポートによると、3D細胞培養市場の世界的な価値は2025年末までに27億米ドルを超えるでしょう。2D培養法と比較して、3D細胞培養は増殖と分化だけでなく、長期生存のためにも最適化できる有利な特性を示します7,8。このような手段により、in vivo細胞の微小環境をシミュレートして、より正確な腫瘍の特性評価と代謝プロファイリングを取得できるため、ゲノムおよびタンパク質の変化をよりよく理解できます。このため、3Dテストシステムは、特に新規抗腫瘍薬のスクリーニングと評価に焦点を当てた主流の医薬品開発業務に含める必要があります。スフェロイド構造における不死化樹立細胞株または初代細胞培養物の三次元増殖は、低酸素症や薬物浸透などの腫瘍のin vivoの特徴、ならびに細胞相互作用、応答、耐性を有しており、in vitro薬物スクリーニングを行うための厳格で代表的なモデルと見なすことができます9,10,11。
ただし、これらの3D培養モデルには、解決に時間がかかる可能性のあるいくつかの問題もあります。細胞スフェロイドはこれらのプロトコルを用いて形成することができるが、培養時間や包埋ゲル12などの特定の詳細が異なるため、これらの構築された細胞スフェロイドは、限られたサイズ範囲では十分に制御できない。スフェロイドのサイズは、生存率試験と画像解析の一貫性に影響を与える可能性があります。増殖微小環境および成長因子も様々であり、細胞13間の分化の違いにより異なる形態をもたらし得る。現在、制御されたサイズですべてのタイプの腫瘍を構築するための標準的で単純で費用効果の高い方法が明らかに必要とされています。
別の観点からは、形態、生存率、および増殖速度を評価するために均質アッセイおよびハイコンテントイメージングアプローチが開発されてきたが、3Dモデルのハイスループットスクリーニングは、腫瘍スフェロイドの位置、サイズ、および形態の均一性の欠如など、文献で報告されているさまざまな理由により依然として課題である14、15、16。
ここで紹介するプロトコルでは、3D腫瘍スフェロイドの構築における各ステップをリストし、オートフォーカス、オートイメージング、および分析などの有利な特性を含むハイスループット、ハイコンテントイメージングシステムを使用したスフェロイド観察および分析の方法について説明します。この方法では、ハイスループットイメージングに適した均一なサイズの3D腫瘍スフェロイドをどのように生成できるかを示します。これらのスフェロイドは、抗がん剤治療に対しても高い感受性を示し、スフェロイドの形態学的変化は、ハイコンテントイメージングを使用して監視できます。要約すると、薬物評価目的で3D腫瘍構築物を生成する手段として、この方法論の堅牢性を実証します。
Protocol
Representative Results
Discussion
微小環境は腫瘍の成長に重要な役割を果たします。それは、細胞外マトリックス、酸素勾配、栄養、および機械的相互作用の提供に影響を与える可能性があり、したがって、遺伝子発現、シグナル経路、および腫瘍細胞の多くの機能に影響を与える可能性があります19、20、21。多くの場合、2D細胞はそのような効果を生み?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究室のすべてのメンバーの批判的な意見と提案に感謝します。この研究は、江蘇省衛生委員会(K2019030)の主要プロジェクトの支援を受けました。概念化はC.W.とZ.C.によって行われ、方法論はW.H.とM.L.によって実行され、調査はW.H.とM.L.によって実行され、データキュレーションはW.H.、Z.Z.、S.X.、およびM.L.によって実行され、元のドラフト準備はZ.Z.、J.Z.、S.X.、W.H.によって実行されました。 とX.L.、レビューと編集はZ.C.によって行われ、プロジェクト管理はC.W.とZ.C.によって行われ、資金獲得はC.W.によって行われました。すべての著者は、原稿の公開バージョンを読み、同意しました。
Materials
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Microscope and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
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