Generering av 3D-tumorsfæroider for legemiddelevalueringsstudier
Summary
Denne artikkelen demonstrerer en standardisert metode for konstruksjon av tredimensjonale tumorsfæroider. En strategi for sfæroidobservasjon og bildebasert dyplæringsanalyse ved hjelp av et automatisert bildesystem er også beskrevet.
Abstract
I de siste tiårene, i tillegg til monolayer-kulturerte celler, har tredimensjonale tumor sfæroider blitt utviklet som et potensielt kraftig verktøy for evaluering av kreftmedisiner. Imidlertid mangler de konvensjonelle kulturmetodene evnen til å manipulere tumorsfæroidene på en homogen måte på tredimensjonalt nivå. For å løse denne begrensningen, presenterer vi i dette papiret en praktisk og effektiv metode for å konstruere gjennomsnittlig størrelse tumor sfæroider. I tillegg beskriver vi en metode for bildebasert analyse ved hjelp av kunstig intelligens-basert analyseprogramvare som kan skanne hele platen og få data på tredimensjonale sfæroider. Flere parametere ble studert. Ved å bruke en standardmetode for tumorsfæroidkonstruksjon og et bildebehandlings- og analysesystem med høy gjennomstrømning, kan effektiviteten og nøyaktigheten av legemiddeltester utført på tredimensjonale sfæroider økes dramatisk.
Introduction
Kreft er en av de sykdommene mennesker frykter mest, ikke minst på grunn av den høye dødeligheten1. De siste årene har muligheten for å behandle kreft økt etter hvert som nye terapier har blitt introdusert 2,3,4,5. Todimensjonale (2D) og tredimensjonale (3D) in vitro-modeller brukes til å studere kreft i laboratorieinnstilling. Imidlertid kan 2D-modeller ikke umiddelbart og nøyaktig vurdere alle viktige parametere som indikerer antitumorfølsomhet; Derfor klarer de ikke fullt ut å representere in vivo-interaksjoner i medisineringstesting6.
Siden 2020 har det globale tredimensjonale (3D) kulturmarkedet blitt kraftig styrket. Ifølge en rapport fra NASDAQ OMX vil den globale verdien av 3D-cellekulturmarkedet overstige USD 2,7 milliarder innen utgangen av 2025. Sammenlignet med 2D-kulturmetoder viser 3D-celledyrking fordelaktige egenskaper, som kan optimaliseres ikke bare for spredning og differensiering, men også for langsiktig overlevelse 7,8. På denne måten kan in vivo cellulære mikromiljøer simuleres for å oppnå mer nøyaktig tumorkarakterisering, samt metabolsk profilering, slik at genomiske og proteinendringer kan forstås bedre. På grunn av dette bør 3D-testsystemer nå inkluderes i vanlige legemiddelutviklingsoperasjoner, spesielt de med fokus på screening og evaluering av nye antitumormedisiner. Tredimensjonale vekster av immortaliserte etablerte cellelinjer eller primære cellekulturer i sfæroide strukturer har in vivo egenskaper av svulster som hypoksi og medikamentpenetrasjon, samt celleinteraksjon, respons og motstand, og kan betraktes som en streng og representativ modell for å utføre in vitro legemiddelscreening 9,10,11.
Imidlertid lider disse 3D-kulturmodellene også av flere problemer som kan ta litt tid å løse. Cellesfæroider kan dannes ved hjelp av disse protokollene, men de varierer i visse detaljer, for eksempel kulturtid eller innebygging av geler12, slik at disse konstruerte cellesfæroider ikke kan kontrolleres godt under et begrenset størrelsesområde. Størrelsen på sfæroidene kan påvirke konsistensen av levedyktighetstesten og bildeanalysen. Vekstmikromiljøene og vekstfaktorene varierer også, noe som kan føre til forskjellige morfologier på grunn av forskjeller i differensieringen mellom celler13. Det er nå et åpenbart behov for en standard, enkel og kostnadseffektiv metode for å konstruere alle typer svulster med kontrollerte størrelser.
Fra et annet perspektiv, selv om homogene analyser og bildebehandlingsmetoder med høyt innhold er utviklet for å evaluere morfologi, levedyktighet og veksthastighet, er screening av 3D-modeller med høy gjennomstrømning fortsatt en utfordring av ulike grunner rapportert i litteraturen, for eksempel mangelen på ensartethet i posisjonen, størrelsen og morfologien til tumorsfæroider14,15,16.
I protokollen som presenteres her, lister vi hvert trinn i konstruksjonen av 3D-tumorsfæroider og beskriver en metode for sfæroidobservasjon og analyse ved hjelp av et bildebehandlingssystem med høy gjennomstrømning og høyt innhold som involverer autofokus, autoavbildning og analyse, blant andre fordelaktige egenskaper. Vi viser hvordan denne metoden kan produsere 3D-tumor sfæroider av ensartet størrelse som er egnet for høy gjennomstrømningsavbildning. Disse sfæroidene viser også høy følsomhet for kreftbehandling, og morfologiske endringer i sfæroidene kan overvåkes ved hjelp av bildebehandling med høyt innhold. Oppsummert demonstrerer vi robustheten til denne metoden som et middel til å generere 3D-tumorkonstruksjoner for legemiddelevalueringsformål.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikromiljøet spiller en viktig rolle i tumorvekst. Det kan påvirke tilførselen av ekstracellulære matriser, oksygengradienter, ernæring og mekanisk interaksjon og dermed påvirke genuttrykk, signalveier og mange funksjoner i tumorceller 19,20,21. I mange tilfeller produserer 2D-celler ikke slike effekter eller til og med produserer motsatte effekter, og påvirker dermed evalueringen av medikamentelle behandlinger. Fremvekst…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle medlemmer av våre laboratorier for deres kritiske innspill og forslag. Denne forskningen ble støttet av Key Project of Jiangsu Commission of Health (K2019030). Konseptualisering ble utført av CW og Z.C., metodikken ble utført av W.H. og M.L., undersøkelsen ble utført av W.H. og M.L., datakurateringen ble utført av W.H., Z.Z., S.X. og M.L., det opprinnelige utkastet ble utført av Z.Z., J.Z., S.X., W.H., og X.L., gjennomgangen og redigeringen ble utført av Z.C., prosjektadministrasjonen ble utført av C.W. og Z.C., og finansieringsanskaffelsen ble utført av C.W. Alle forfatterne har lest og samtykket til den publiserte versjonen av manuskriptet.
Materials
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Microscope and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
References
- Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
- Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).
- Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy. FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).
- Shokooohi, A., et al. Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world. Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).
- Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 116 (2021).
- Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells. Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).
- Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species. FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. 3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments. Scientific Reports. 10, 1653 (2020).
- Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer. Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
- Carragher, N., et al. Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models. Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).
- Huang, Y., et al. Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).
- Yazdanfar, S., et al. Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy. Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).
- Chen, Z., et al. Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition. Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).
- Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).
- Anastasiou, D., et al. Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape. British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).
- Zhou, H., et al. Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis. Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).
- Zhu, G. G., et al. Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance. Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).
- Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy. Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).
- Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
- Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
