यह प्रोटोकॉल माउस ओविडक्ट में क्षेत्रीय रूप से प्रतिबंधित सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता जीनोम संपादन के लिए माइक्रोइंजेक्शन और विवो इलेक्ट्रोपोरेशन में वर्णन करता है।
जर्मलाइन आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (जी-जीईएमएम) ने विकास, होमियोस्टैसिस और बीमारी में विवो जीन फ़ंक्शन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हालांकि, कॉलोनी निर्माण और रखरखाव से जुड़े समय और लागत अधिक हैं। सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता जीनोम संपादन में हालिया प्रगति ने कोशिका / ऊतक / रुचि के अंग को सीधे लक्षित करके दैहिक जीईएमएम (एस-जीईएमएम) की पीढ़ी की अनुमति दी है।
मनुष्यों में ओविडक्ट, या फैलोपियन ट्यूब को सबसे आम डिम्बग्रंथि के कैंसर, उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा (एचजीएससी) का ऊतक-मूल माना जाता है। एचजीएससी गर्भाशय से बाहर फैलोपियन ट्यूब के क्षेत्र में शुरू होता है, जो अंडाशय से सटे होता है, लेकिन समीपस्थ फैलोपियन ट्यूब नहीं। हालांकि, एचजीएससी के पारंपरिक माउस मॉडल पूरे ओविडक्ट को लक्षित करते हैं, और इस प्रकार मानव स्थिति को पुन: उत्पन्न नहीं करते हैं। हम डिंबवाहिनी के साथ प्रतिबंधित क्षेत्रों में म्यूकोसल उपकला कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए ओविडक्ट लुमेन में और विवो इलेक्ट्रोपोरेशन में डीएनए, आरएनए, या राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) समाधान माइक्रोइंजेक्शन की एक विधि प्रस्तुत करते हैं। कैंसर मॉडलिंग के लिए इस पद्धति के कई फायदे हैं, जैसे 1) क्षेत्र / ऊतक / अंग और इलेक्ट्रोपोरेशन के क्षेत्र को लक्षित करने में उच्च अनुकूलनशीलता, 2) लक्षित सेल प्रकारों में उच्च लचीलापन (सेलुलर प्लैंसी) जब कैस 9 अभिव्यक्ति के लिए विशिष्ट प्रमोटरों के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, 3) इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं की संख्या में उच्च लचीलापन (अपेक्षाकृत कम आवृत्ति), 4) कोई विशिष्ट माउस लाइन की आवश्यकता नहीं है (इम्यूनोसक्षम रोग मॉडलिंग), 5) जीन उत्परिवर्तन संयोजन में उच्च लचीलापन, और 6) सीआरई रिपोर्टर लाइन के साथ संयोजन में उपयोग किए जाने पर इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को ट्रैक करने की संभावना। इस प्रकार, यह लागत प्रभावी विधि मानव कैंसर की शुरुआत को पुन: उत्पन्न करती है।
फैलोपियन ट्यूब, जिसे चूहों में ओविडक्ट कहा जाता है, एक ट्यूबलर संरचना है जो गर्भाशय को अंडाशय से जोड़ती है। यह स्तनधारी प्रजनन में एक आवश्यक भूमिका निभाता है, आंतरिक निषेचन और प्रीइम्प्लांटेशनविकास के लिए वातावरण प्रदान करता है। इसके महत्व के बावजूद, इसके कार्य और होमियोस्टैसिस के बारे में बहुत कम जानकारी है, आंशिक रूप से इन विट्रो निषेचन तकनीकों के विकास के कारण इस अंगसे संबंधित किसी भी बांझपन के मुद्दे को दरकिनार करना। हालांकि, यह माना गया है कि उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा (एचजीएससी) के प्रीकैंसरस घाव, डिम्बग्रंथि के कैंसर का एक आक्रामक हिस्टोटाइप जो लगभग 75% डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा और 85% संबंधित मौतों के लिए जिम्मेदार है, डिस्टल फैलोपियन ट्यूब एपिथेलियम 5,6,7,8 तक ही सीमित हैं।. यह इंगित करता है कि हमारे शरीर में सभी कोशिकाएं ऑन्कोजेनिक अपमान के लिए समान रूप से अतिसंवेदनशील नहीं होती हैं, बल्कि प्रत्येक ऊतक / अंग में केवल अद्वितीय / अतिसंवेदनशील कोशिकाएं कैंसर में सेल-ऑफ-ओरिजिन बन जाती हैं – जिसे सेलुलर प्लिएन्सी9 कहा जाता है। इन लाइनों के साथ, यह दिखाया गया है कि अंडाशय से सटे डिस्टल फैलोपियन ट्यूब की उपकला कोशिकाएं बाकी ट्यूब10,11 से अलग हैं। इस प्रकार, एचजीएससी के पारंपरिक माउस मॉडल, जो ओविडक्ट में सभी कोशिकाओं को लक्षित करते हैं, मानव स्थिति को पुन: उत्पन्न नहीं करते हैं। हाल के एक अध्ययन में, हमने डिस्टल माउस ओविडक्ट12,13 में चार ट्यूमर शमन जीन को परिवर्तित करके एचजीएससी को सफलतापूर्वक प्रेरित करने के लिए विवो ओविडक्ट इलेक्ट्रोपोरेशन और सीआरई-आधारित वंश अनुरेखण में सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता जीनोम संपादन के संयोजन का उपयोग किया। यह पांडुलिपि माउस ओविडक्ट म्यूकोसल एपिथेलियम को लक्षित करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन और विवो इलेक्ट्रोपोरेशन की इस प्रक्रिया का वर्णन करते हुए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है।
इस विधि के कई फायदे हैं। इसे अंग पैरेन्काइमा14 सहित अन्य ऊतकों / अंगों को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यद्यपि लेंटीवायरल और एडेनोवायरल सिस्टम जैसे अन्य विवो जीन डिलीवरी दृष्टिकोणों का उपयोग समान ऊतक / अंग-विशिष्ट लक्ष्यीकरण को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, लक्ष्यीकरण के क्षेत्र को इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित वितरण के लिए चिमटी-प्रकार इलेक्ट्रोड के विभिन्न आकारों का उपयोग करके अधिक आसानी से समायोजित किया जाता है। राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी), इलेक्ट्रोपोरेशन पैरामीटर और इलेक्ट्रोड के आकार की एकाग्रता के आधार पर, इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं की संख्या को बदला जा सकता है। इसके अलावा, विशिष्ट सेल प्रकारों को लक्षित किया जा सकता है जब कैस 9 अभिव्यक्ति के लिए प्रोमोटर्स के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, जर्मलाइन आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (जी-जीईएमएम) की पूर्ण आवश्यकता के बिना। इसके अलावा, वायरल डिलीवरी सिस्टम के विपरीत, इलेक्ट्रोपोरेशन एकल कोशिकाओं में कई प्लास्मिड डिलीवरी की अनुमति देता है और डीएनए आकार15 डालने में कम बाधा डालता है। विवो में जीन उत्परिवर्तन की स्क्रीनिंग भी इस उच्च लचीलेपन के कारण सापेक्ष आसानी से की जा सकती है। इसके अलावा, इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को ट्रैक या ट्रेस किया जा सकता है जब इस विधि का उपयोग क्रे रिपोर्टर लाइनों जैसे कि टीडीटोमेटो या कॉन्फेट्टी16,17 के साथ संयोजन में किया जाता है।
इस विस्तृत प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम ओविडक्ट लुमेन में डीएनए / आरएनए / आरएनपी समाधान का माइक्रोइंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन ताकत और क्षेत्र का नियंत्रण है। माइक्रोइंजेक्शन के दौरान डीएनए/आरएनए/आरएनपी घोल रिसाव के कारण अवांछित क्षेत्रों/कोशिकाओं का अभिकर्मक हो सकता है। सुसंगत और कुशल इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए, समाधान (चित्रा 3 सी, डी) के साथ ओविडक्ट लुमेन को भरना बेहतर है। ऐसा इसलिए है क्योंकि इलेक्ट्रोपोरेशन का क्षेत्र मुख्य रूप से इलेक्ट्रोड आकार और प्लेसमेंट द्वारा नियंत्रित होता है। कमजोर इलेक्ट्रोपोरेशन इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं की संख्या को कम करता है, और कठोर इलेक्ट्रोपोरेशन अवांछित कोशिकाओं के इलेक्ट्रोपोरेशन का कारण बन सकता है या ऊतक संरचना को बाधित कर सकता है। डीएनए / आरएनए / आरएनए समाधान एकाग्रता या इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों को समायोजित करके इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं की संख्या को भिन्न किया जा सकता है। हालांकि, चूंकि इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान उच्च वोल्टेज / गर्मी उत्पादन ऊतक को नुकसान पहुंचा सकता है, इसलिए इन मापदंडों को जीवित / एनेस्थेटाइज्ड चूहों पर उपयोग करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए। अंत में, इस प्रक्रिया की मांग प्रकृति के कारण, जीवित / एनेस्थेटाइज्ड चूहों पर इस सर्जरी को करने से पहले मृत चूहों पर ट्रैक्ट एक्सपोजर और माइक्रोइंजेक्शन का अभ्यास करने की सिफारिश की जाती है।
यह माना जाता है कि कैंसर की शुरुआत में कई जीन शामिल होते हैं, इस प्रकार, इस घटना को पुन: उत्पन्न करने के लिए कई जीनों के बहु-एलील संशोधन की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, यह भी ज्ञात है कि सभी कोशिकाएं ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्तन9 के लिए समान रूप से अतिसंवेदनशील नहीं हैं। इसलिए, कैंसर मॉडलिंग को ऑन्कोजेनिक अपमान के कड़े नियंत्रण को प्राप्त करने के लिए विशिष्ट क्रे माउस लाइनों की आवश्यकता होती है। हालांकि, उनकी उपलब्धता और विशिष्टता विभिन्न चुनौतियों का कारण बनती है, जिसमें गैर-लक्षित ऊतकों और घातकतामें प्रभाव शामिल हैं। इसके अलावा, पारंपरिक जी-जीईएमएम रखरखाव के लिए उच्च लागत उठाते हैं और माउस लाइन उत्पादन के लिए समय की आवश्यकता होती है। CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन तकनीक के विकास और विशिष्ट दैहिक कोशिकाओं में जीन वितरण में सुधार ने हमें इन मुद्दों को दूर करने की अनुमति दी है। इस प्रोटोकॉल में, हम दैहिक जीनोम हेरफेर के लिए एक डीएनए / आरएनए / आरएनपी वितरण विधि प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग कैंसर मॉडलिंग के लिए किया जा सकता है, विशिष्ट माउस लाइनों12 की पूर्ण आवश्यकता के बिना। डीएनए /आरएनए / आरएनपी समाधानों को लुमेन में इंजेक्ट करके और इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित वितरण के लिए चिमटी-प्रकार के इलेक्ट्रोड के विभिन्न आकारों का उपयोग करके, माउस ओविडक्ट म्यूकोसल एपिथेलियम के प्रतिबंधित क्षेत्रों को लक्षित किया जाता है (चित्रा 4 ए-एफ)। यह विशेष रूप से एचजीएससी की दीक्षा को मॉडलिंग में उपयोगी है जो फैलोपियन ट्यूब के डिस्टल छोर से उत्पन्न होता है।
प्रस्तुत माइक्रोइंजेक्शन और विवो इलेक्ट्रोपोरेशन विधि में एक लुमेन के साथ ऊतकों / अंगों को लक्षित करने के लिए अत्यधिक बहुमुखी है। इस विधि14 का उपयोग करके अंग पैरेन्काइमा भी लक्षित है। लेंटिवायरल और एडेनोवायरल सिस्टम जैसे वायरल डिलीवरी दृष्टिकोण का उपयोग इसी तरह के उद्देश्यों के लिए भी किया जा सकता है। हालांकि, वायरल डिलीवरी दृष्टिकोण पर इलेक्ट्रोपोरेशन के फायदे हैं: 1) एकल कोशिकाओं में कई प्लास्मिड वितरण, 2) सम्मिलित आकार15 पर कोई प्रतिबंध नहीं, और 3) क्षेत्र और वितरण के समय का आसान नियंत्रण। इसके अलावा, वंश विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग करके लक्ष्यीकरण विशिष्टता में सुधार किया जा सकता है। वायरल पैकेजिंग पर सीमा के कारण वायरल सिस्टम में यह कभी-कभी मुश्किल होता है।
जैसा कि इलेक्ट्रोपोरेशन की प्रकृति है, इलेक्ट्रोपोरेटेड उपकला कोशिकाओं को यादृच्छिक रूप से स्वस्थ, असंपादित कोशिकाओं (चित्रा 4 जी) के साथ जोड़ा जाता है। हालांकि, आनुवंशिक रूप से संशोधित और असंशोधित कोशिकाओं में यह मोज़ेकिज्म कैंसर की शुरुआत का अध्ययन करने के लिए फायदेमंद हो सकता है, क्योंकि यह एक इम्यूनोसक्षम माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर प्रारंभिक कैंसर दीक्षा की छिटपुट प्रकृति को पुन: उत्पन्न करता है। इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं की आवृत्ति को डीएनए / आरएनए / आरएनपी समाधान सांद्रता और / या इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों को बदलकर समायोजित किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में CRISPR-Cas-मध्यस्थ जीन संपादन का उपयोग करके, कई जीनों को स्क्रीन करना और लक्षित जीनों में उत्परिवर्तन / एलील संयोजनों के विषम पैटर्न उत्पन्न करना आसान है; यह कैंसर मॉडलिंग में विशेष रूप से उपयोगी है जो एचजीएससी20,21 जैसे जीनोमिक परिवर्तनों की काफी संख्या के साथ मौजूद है। इसके अलावा, कैंसर की प्रगति के दौरान लक्षित जीन ों को अनुक्रमित करके, इम्यूनोसक्षमचूहों में ट्यूमर और मेटास्टेस के विवो क्लोनल विकास का पालन करना संभव है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक प्रतिनिधि परिणाम और प्रोटोकॉल अनुकूलन उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड प्रदान करने के लिए केटी टेंग और डॉ मैथ्यू जे फोर्ड को धन्यवाद देते हैं। केएच को फोंड्स डी रेचरचे डू क्यूबेक – सैंटे (एफआरक्यूएस) डॉक्टरेट अनुदान, डोनर फाउंडेशन, डेल्टा कप्पा गामा वर्ल्ड फैलोशिप, सेंटर फॉर रिसर्च इन रिप्रोडक्शन एंड डेवलपमेंट (सीआरआरडी), ह्यूग ई बर्क, रोलैंड और मार्सेल गोसेलिन और अलेक्जेंडर मैकफी स्नातक छात्रों द्वारा समर्थित किया गया था।
0.22 µm sterile filter unit | LifeGene | SF0.22PES | |
1 mL syringe | Terumo Medical Corportation | SS-01T | |
1 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P1 | |
3 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P3 | |
30G x 1/2 Needle | BD | 305106 | Needle is attached to the 1 mL syringe when using injectable anesthetic or analgesic. |
Adson forceps | Fisher Scientific | 10-000-451 | |
Air-pressured syringe | BD | B302995 | Attached to the micromanipulator; as shown in Figure 2B |
Analgesic | – | – | Carprofen, dose: 5mg/kg. |
Antiseptic | Cardinal Health | OMEL0000017 | Baxedin: 2% chlorhexidine in 70% isopropyl alcohol |
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) – Anesthetic | Sigma Aldrich | T48402-25G | |
Clamp mount micromanipulator | AD Instruments | MM-33 | |
Curved serrated forceps | Fisher Scientific | NC0696845 | |
Dissecting microscope | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Attached KL 200 LED for top light, labelled as light source in Figure 2B. |
Eye lubricant | Alcon | – | Systane ointment (Lubricant eye ointment) |
Glass capillary needles | Sutter Instrument Co. | B100–50-10 | Outside diameter: 1 mm, inside diameter: 0.5 mm, length: 10 cm |
Hartman hemostats | Fisher Scientific | 50-822-711 | |
Heating pad/disc | – | – | SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad was used in this protocol. Microwave for 2-5min, and test with back of gloved hand. |
Magnetic Mount for micromanipulator | AD Instruments | MB-B | Used to keep the clamp mount micromanipulator stable and upright during injection. |
Micro bulldog clamp | Fisher Scientific | 50-822-230 | 3 cm |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | P-97 Flaming/Brown type micropipette puller. Program used: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70 |
Petri dish | Fisher Scientific | 263991 | Autoclaved/sterile glass petridishes can also be used. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic Inc. | PD8117 | 10X PBS was diluted to 1X with DI water. Autoclave before use. |
Pulse generator/Electroporator | BEX CO., LTD | CUY21 EDIT II | Electroporation settings: 30 V, 3 pulses, 1 s interval, P. length = 50 ms, unipolar |
Rosa-LSLtdTomato mice | The Jackson Laboratory | 7914 | Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J |
Sharp-blunt dissection scissors | Fisher Scientific | 28251 | |
Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | SDI130 | |
Shaver | – | – | Hair removal cream can also be used. |
Silk braided sutures | Ethicon | 682G | 3/8 circle, gauge: 5-0, needle size: 18 mm, thread length: 75 cm. Staples can also be used. |
Tapered ultrafine tip forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
Thin absorbent paper | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Kimwipes |
Trypan blue | STEMCELL Technologies | 7050 | Filtered using 0.22 µm sterile filter before use for microinjection. |