Denne protokollen beskriver mikroinjeksjon og in vivo elektroporering for regionalt begrenset CRISPR-mediert genomredigering i museovidukten.
Germline genetisk konstruerte musemodeller (G-GEMM) har gitt verdifull innsikt i in vivo genfunksjon i utvikling, homeostase og sykdom. Imidlertid er tiden og kostnadene forbundet med koloniopprettelse og vedlikehold høye. Nylige fremskritt innen CRISPR-mediert genomredigering har gjort det mulig å generere somatiske GEMMs (S-GEMM) ved direkte å målrette cellen / vevet / organet av interesse.
Ovidukten, eller egglederen hos mennesker, regnes som opprinnelsesvevet til den vanligste eggstokkreften, høyverdige serøse ovariekarsinomer (HGSC). HGSCs starter i regionen av egglederen distalt for livmoren, som ligger ved siden av eggstokken, men ikke den proksimale egglederen. Imidlertid retter tradisjonelle musemodeller av HGSC seg mot hele ovidukten, og rekapitulerer dermed ikke den menneskelige tilstanden. Vi presenterer en metode for DNA, RNA eller ribonukleoprotein (RNP) løsning mikroinjeksjon i oviduktlumen og in vivo elektroporering for å målrette mukosale epitelceller i begrensede områder langs ovidukten. Det er flere fordeler med denne metoden for kreftmodellering, for eksempel 1) høy tilpasningsevne ved målretting av området / vev / organ og region av elektroporering, 2) høy fleksibilitet i målrettede celletyper (cellulær pliancy) når den brukes i kombinasjon med spesifikke promotorer for Cas9-uttrykk, 3) høy fleksibilitet i antall elektroporerte celler (relativt lav frekvens), 4) ingen spesifikk muselinje er nødvendig (immunkompetent sykdomsmodellering), 5) høy fleksibilitet i genmutasjonskombinasjon, og 6) mulighet for å spore elektroporerte celler når de brukes i kombinasjon med en Cre reporter-linje. Dermed rekapitulerer denne kostnadseffektive metoden human kreftinitiering.
Egglederen, kalt ovidukten hos mus, er en rørformet struktur som forbinder livmoren til eggstokken. Det spiller en viktig rolle i pattedyrs reproduksjon, og gir miljøet for intern befruktning og preimplantasjonsutvikling 1,2. Til tross for sin betydning, er lite kjent om sin funksjon og homeostase, delvis på grunn av utviklingen av in vitro fertiliseringsteknikker som omgår eventuelle infertilitetsproblemer relatert til dette organet3. Imidlertid har det blitt anerkjent at forstadier til kreft av høyverdig serøs ovariekarsinom (HGSC), en aggressiv histotype av eggstokkreft som står for rundt 75% av eggstokkkarsinomer og 85% av relaterte dødsfall4, er begrenset til det distale egglederepitelet 5,6,7,8 . Dette indikerer at ikke alle celler i kroppen vår er like utsatt for onkogene fornærmelser, men heller bare unike / følsomme celler i hvert vev / organ blir opprinnelsescellen i kreft – kalt cellulær pliancy9. Langs disse linjene har det vist seg at epitelcellene i det distale egglederen, som ligger ved siden av eggstokken, er forskjellige fra resten av røret10,11. Dermed rekapitulerer tradisjonelle musemodeller av HGSC, som retter seg mot alle celler i ovidukten, ikke den menneskelige tilstanden. I en nylig studie brukte vi en kombinasjon av CRISPR-mediert genomredigering, in vivo oviduktelektroporering og Cre-basert avstamningssporing for å lykkes med å indusere HGSC ved å mutere fire tumorsuppressorgener i den distale musovidukten12,13. Dette manuskriptet presenterer en trinnvis protokoll som beskriver denne prosedyren for mikroinjeksjon og in vivo elektroporering for å målrette musens ovidukt slimhinneepitel.
Denne metoden har flere fordeler. Det kan tilpasses for å målrette mot andre vev / organer, inkludert organparenchyma14. Selv om andre in vivo genleveringsmetoder som lentivirale og adenovirale systemer kan brukes til å oppnå lignende vev / organspesifikk målretting, blir målrettingsområdet lettere justert ved hjelp av forskjellige størrelser av pinsett-type elektroder for elektroporasjonsbasert levering. Avhengig av konsentrasjonen av DNA / RNA / ribonukleoproteiner (RNP), elektroporeringsparametere og størrelse på elektroder, kan antall elektroporerte celler endres. Videre kan spesifikke celletyper målrettes når de brukes i kombinasjon med promotorer for Cas9-uttrykk, uten absolutt behov for Germline genetisk konstruerte musemodeller (G-GEMM). I tillegg, i motsetning til virale leveringssystemer, tillater elektroporering multippel plasmidlevering i enkeltceller og mindre begrensning i innsatt DNA-størrelse15. In vivo screening av genmutasjoner kan også utføres relativt enkelt på grunn av denne høye fleksibiliteten. Videre kan elektroporerte celler spores eller spores når denne metoden brukes i kombinasjon med Cre reporter-linjer som Tdtomato eller Confetti16,17.
Avgjørende trinn i denne detaljerte protokollen er mikroinjeksjon av DNA / RNA / RNP-løsning i oviduktlumen og kontroll av elektroporasjonsstyrken og området. DNA/RNA/RNP-løsningslekkasje under mikroinjeksjon kan forårsake transfeksjon av uønskede områder/celler. For konsistent og effektiv elektroporering er det å foretrekke å fylle oviduktlumen med løsningen (figur 3C, D). Dette skyldes at området for elektroporering hovedsakelig styres av elektrodestørrelse og plassering. Svak elektroporering reduserer antall elektroporerte celler, og hard elektroporering kan forårsake elektroporering av uønskede celler eller forstyrre vevstrukturen. Antall elektroporerte celler kan varieres ved å justere DNA / RNA / RNP-løsningskonsentrasjonen eller elektroporasjonsparametrene. Men siden høye spenninger / varmeproduksjon under elektroporering kan skade vevet, bør disse parametrene testes før bruk på levende / bedøvede mus. Til slutt, på grunn av den krevende naturen til denne prosedyren, anbefales det å øve kanaleksponering og mikroinjeksjon på døde mus før du utfører denne operasjonen på levende / bedøvede mus.
Det er anerkjent at flere gener er involvert i kreftinitiering, og dermed krever rekapitulering av denne hendelsen multi-allelisk modifikasjon av flere gener. I tillegg er det også kjent at ikke alle celler er like utsatt for onkogene mutasjoner9. Kreftmodellering krever derfor spesifikke Cre-muselinjer for å oppnå tett kontroll over onkogene fornærmelser. Imidlertid forårsaker deres tilgjengelighet og spesifisitet ulike utfordringer, inkludert effekter i ikke-målrettede vev og dødelighet19. Videre medfører tradisjonelle G-GEMM-er høye kostnader for vedlikehold og krever tid for generering av muselinjer. Utviklingen av CRISPR / Cas9 genomredigeringsteknologi og forbedring av genlevering i spesifikke somatiske celler har gitt oss mulighet til å overvinne disse problemene. I denne protokollen presenterer vi en DNA/RNA/RNP leveringsmetode for somatisk genommanipulasjon som kan brukes til kreftmodellering, uten absolutt behov for spesifikke muselinjer12. Ved å injisere DNA / RNA / RNP-løsninger i lumen og bruke forskjellige størrelser av pinsett-type elektroder for elektroporasjonsbasert levering, er begrensede områder av musens ovidukt slimhinneepitel målrettet (figur 4A-F). Dette er spesielt nyttig ved modellering av initiering av HGSC som stammer fra den distale enden av egglederen.
Den presenterte mikroinjeksjons- og in vivo-elektroporeringsmetoden er svært allsidig for å målrette vev / organer med lumen. Organparenchyma er også målrettet ved hjelp av denne metoden14. Virale leveringsmetoder, som lentivirale og adenovirale systemer, kan også brukes til lignende formål. Imidlertid er fordelene med elektroporering over virale leveringsmetoder: 1) multippel plasmidlevering i enkeltceller, 2) ingen begrensning på innsatsstørrelsen15 og 3) enkel kontroll av området og tidspunktet for levering. I tillegg kan målrettingsspesifisitet forbedres ved å bruke avstamningsspesifikke promotører. Dette er noen ganger vanskelig i virale systemer på grunn av grensen for viral emballasje.
Som det er naturen til elektroporering, er elektroporerte epitelceller tilfeldig ispedd sunne, uredigerte celler (figur 4G). Imidlertid kan denne mosaikken i genmodifiserte og umodifiserte celler være fordelaktig for å studere kreftinitiering, da den rekapitulerer den sporadiske karakteren av tidlig kreftinitiering i et immunkompetent mikromiljø. Frekvensen av elektroporerte celler kan justeres ved å variere DNA / RNA / RNP-løsningskonsentrasjonene og / eller elektroporasjonsparametrene. Ved å bruke CRISPR-Cas-mediert genredigering i kombinasjon med den presenterte protokollen, er det enkelt å screene flere gener og generere heterogene mønstre av mutasjoner / alleliske kombinasjoner i målrettede gener; Dette er spesielt nyttig ved modellering av kreft som presenterer et betydelig antall genomiske endringer som HGSCs20,21. Videre, ved å sekvensere målrettede gener under kreftprogresjon, er det mulig å følge in vivo klonal evolusjon av svulster og metastaser i immunkompetente mus12.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Katie Teng og Dr. Matthew J. Ford for å gi plasmider som brukes til å generere representative resultater og protokolloptimalisering. KH ble støttet av Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS) doktorgradsstipend, Donnor Foundation, Delta Kappa Gamma World Fellowship, Senter for forskning i reproduksjon og utvikling (CRRD), Hugh E. Burke, Rolande &; Marcel Gosselin, og Alexander McFee graduate studentships.
0.22 µm sterile filter unit | LifeGene | SF0.22PES | |
1 mL syringe | Terumo Medical Corportation | SS-01T | |
1 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P1 | |
3 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P3 | |
30G x 1/2 Needle | BD | 305106 | Needle is attached to the 1 mL syringe when using injectable anesthetic or analgesic. |
Adson forceps | Fisher Scientific | 10-000-451 | |
Air-pressured syringe | BD | B302995 | Attached to the micromanipulator; as shown in Figure 2B |
Analgesic | – | – | Carprofen, dose: 5mg/kg. |
Antiseptic | Cardinal Health | OMEL0000017 | Baxedin: 2% chlorhexidine in 70% isopropyl alcohol |
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) – Anesthetic | Sigma Aldrich | T48402-25G | |
Clamp mount micromanipulator | AD Instruments | MM-33 | |
Curved serrated forceps | Fisher Scientific | NC0696845 | |
Dissecting microscope | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Attached KL 200 LED for top light, labelled as light source in Figure 2B. |
Eye lubricant | Alcon | – | Systane ointment (Lubricant eye ointment) |
Glass capillary needles | Sutter Instrument Co. | B100–50-10 | Outside diameter: 1 mm, inside diameter: 0.5 mm, length: 10 cm |
Hartman hemostats | Fisher Scientific | 50-822-711 | |
Heating pad/disc | – | – | SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad was used in this protocol. Microwave for 2-5min, and test with back of gloved hand. |
Magnetic Mount for micromanipulator | AD Instruments | MB-B | Used to keep the clamp mount micromanipulator stable and upright during injection. |
Micro bulldog clamp | Fisher Scientific | 50-822-230 | 3 cm |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | P-97 Flaming/Brown type micropipette puller. Program used: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70 |
Petri dish | Fisher Scientific | 263991 | Autoclaved/sterile glass petridishes can also be used. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic Inc. | PD8117 | 10X PBS was diluted to 1X with DI water. Autoclave before use. |
Pulse generator/Electroporator | BEX CO., LTD | CUY21 EDIT II | Electroporation settings: 30 V, 3 pulses, 1 s interval, P. length = 50 ms, unipolar |
Rosa-LSLtdTomato mice | The Jackson Laboratory | 7914 | Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J |
Sharp-blunt dissection scissors | Fisher Scientific | 28251 | |
Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | SDI130 | |
Shaver | – | – | Hair removal cream can also be used. |
Silk braided sutures | Ethicon | 682G | 3/8 circle, gauge: 5-0, needle size: 18 mm, thread length: 75 cm. Staples can also be used. |
Tapered ultrafine tip forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
Thin absorbent paper | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Kimwipes |
Trypan blue | STEMCELL Technologies | 7050 | Filtered using 0.22 µm sterile filter before use for microinjection. |