Somatiske genomkonstruerte musemodeller ved bruk av in vivo mikroinjeksjon og elektroporering

Summary

Denne protokollen beskriver mikroinjeksjon og in vivo elektroporering for regionalt begrenset CRISPR-mediert genomredigering i museovidukten.

Abstract

Germline genetisk konstruerte musemodeller (G-GEMM) har gitt verdifull innsikt i in vivo genfunksjon i utvikling, homeostase og sykdom. Imidlertid er tiden og kostnadene forbundet med koloniopprettelse og vedlikehold høye. Nylige fremskritt innen CRISPR-mediert genomredigering har gjort det mulig å generere somatiske GEMMs (S-GEMM) ved direkte å målrette cellen / vevet / organet av interesse.

Ovidukten, eller egglederen hos mennesker, regnes som opprinnelsesvevet til den vanligste eggstokkreften, høyverdige serøse ovariekarsinomer (HGSC). HGSCs starter i regionen av egglederen distalt for livmoren, som ligger ved siden av eggstokken, men ikke den proksimale egglederen. Imidlertid retter tradisjonelle musemodeller av HGSC seg mot hele ovidukten, og rekapitulerer dermed ikke den menneskelige tilstanden. Vi presenterer en metode for DNA, RNA eller ribonukleoprotein (RNP) løsning mikroinjeksjon i oviduktlumen og in vivo elektroporering for å målrette mukosale epitelceller i begrensede områder langs ovidukten. Det er flere fordeler med denne metoden for kreftmodellering, for eksempel 1) høy tilpasningsevne ved målretting av området / vev / organ og region av elektroporering, 2) høy fleksibilitet i målrettede celletyper (cellulær pliancy) når den brukes i kombinasjon med spesifikke promotorer for Cas9-uttrykk, 3) høy fleksibilitet i antall elektroporerte celler (relativt lav frekvens), 4) ingen spesifikk muselinje er nødvendig (immunkompetent sykdomsmodellering), 5) høy fleksibilitet i genmutasjonskombinasjon, og 6) mulighet for å spore elektroporerte celler når de brukes i kombinasjon med en Cre reporter-linje. Dermed rekapitulerer denne kostnadseffektive metoden human kreftinitiering.

Introduction

Egglederen, kalt ovidukten hos mus, er en rørformet struktur som forbinder livmoren til eggstokken. Det spiller en viktig rolle i pattedyrs reproduksjon, og gir miljøet for intern befruktning og preimplantasjonsutvikling ^1,2. Til tross for sin betydning, er lite kjent om sin funksjon og homeostase, delvis på grunn av utviklingen av in vitro fertiliseringsteknikker som omgår eventuelle infertilitetsproblemer relatert til dette organet³. Imidlertid har det blitt anerkjent at forstadier til kreft av høyverdig serøs ovariekarsinom (HGSC), en aggressiv histotype av eggstokkreft som står for rundt 75% av eggstokkkarsinomer og 85% av relaterte dødsfall⁴, er begrenset til det distale egglederepitelet 5,6,7,8 . Dette indikerer at ikke alle celler i kroppen vår er like utsatt for onkogene fornærmelser, men heller bare unike / følsomme celler i hvert vev / organ blir opprinnelsescellen i kreft – kalt cellulær pliancy⁹. Langs disse linjene har det vist seg at epitelcellene i det distale egglederen, som ligger ved siden av eggstokken, er forskjellige fra resten av røret^10,11. Dermed rekapitulerer tradisjonelle musemodeller av HGSC, som retter seg mot alle celler i ovidukten, ikke den menneskelige tilstanden. I en nylig studie brukte vi en kombinasjon av CRISPR-mediert genomredigering, in vivo oviduktelektroporering og Cre-basert avstamningssporing for å lykkes med å indusere HGSC ved å mutere fire tumorsuppressorgener i den distale musovidukten^12,13. Dette manuskriptet presenterer en trinnvis protokoll som beskriver denne prosedyren for mikroinjeksjon og in vivo elektroporering for å målrette musens ovidukt slimhinneepitel.

Denne metoden har flere fordeler. Det kan tilpasses for å målrette mot andre vev / organer, inkludert organparenchyma¹⁴. Selv om andre in vivo genleveringsmetoder som lentivirale og adenovirale systemer kan brukes til å oppnå lignende vev / organspesifikk målretting, blir målrettingsområdet lettere justert ved hjelp av forskjellige størrelser av pinsett-type elektroder for elektroporasjonsbasert levering. Avhengig av konsentrasjonen av DNA / RNA / ribonukleoproteiner (RNP), elektroporeringsparametere og størrelse på elektroder, kan antall elektroporerte celler endres. Videre kan spesifikke celletyper målrettes når de brukes i kombinasjon med promotorer for Cas9-uttrykk, uten absolutt behov for Germline genetisk konstruerte musemodeller (G-GEMM). I tillegg, i motsetning til virale leveringssystemer, tillater elektroporering multippel plasmidlevering i enkeltceller og mindre begrensning i innsatt DNA-størrelse¹⁵. In vivo screening av genmutasjoner kan også utføres relativt enkelt på grunn av denne høye fleksibiliteten. Videre kan elektroporerte celler spores eller spores når denne metoden brukes i kombinasjon med Cre reporter-linjer som Tdtomato eller Confetti^16,17.

Protocol

Dyrene ble plassert i statiske mikroisolasjonsbur med filtertopper, plassert i et dedikert rom som inneholdt et type II biosikkerhetsskap. Alt dyrearbeid ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer og ble godkjent av McGill Universitys fakultet for medisin og helsevitenskap Animal Care Committee (AUP #7843). 1. Klargjøring av mikroinjeksjonskanyle Trekk et kapillærrør av glass inn i et skarpt punkt ved hjelp av en mikropipettetrekker med følgende program: P = 500, Varme = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70. Bruk et par koniske ultrafine spisstanger, klipp den spisse enden av det trukne kapillærrøret under et dissekerende mikroskop for å skape en åpning, som vist i figur 1A, B. Pass på at åpningen ikke er for stor, da dette vil skade ovidukten og forhindre langsom injeksjon. Figur 1: Klargjøring av mikroinjeksjonskanyle. (A,B) Trukket kapillærrør med en spiss ende (A) som ble klippet for å skape en åpning (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 2. Klargjøre bedøvelsen for intraperitoneal injeksjon Forbered filtrert, fortynnet avertin på operasjonsdagen. Avertin (2,2,2-tribromoetanol) stamløsning fremstilles ved en konsentrasjon på 1,6 g/ml i tert-amylalkohol ved kraftig omrøring og lagres i mørket. Fortynn stamoppløsningen med 1,25 % v/v isoton saltoppløsning til en endelig konsentrasjon på 20 mg/ml inne i en avtrekkshette. Vortex det fortynnede avertin og filtrer gjennom et 0,22 μm sterilt filter. Oppbevares i mørket. 3. Klargjøring av operasjonsområdet Operasjonsområdet bør være et dedikert sterilt miljø, helst en ren benk eller biosikkerhetsskap. Ordne sterilt kirurgisk utstyr, mikroskop, mikromanipulator og elektroporator etter behov. Et eksempel på dette er vist i figur 2. Varm opp varmeputen/platen og plasser den under et rent, fullt utstyrt bur. Dette buret vil bli brukt til å huse musene etter operasjonen. Hell sterilt 1x fosfatbufret saltvann (PBS) i en steril petriskål. Bruk en ren saks til å kutte absorberende papir i firkanter, med omtrentlige dimensjoner på 1 cm x 1 cm. Slipp disse bitene absorberende papir i 1x PBS for å suge dem. 4. Klargjøre oppløsningen og kanylen for injeksjon Klargjør injeksjonsløsningen på operasjonsdagen. Bland DNA / RNA / RNP med filtrert trypanblå til en minimum endelig konsentrasjon på henholdsvis 200 ng / μL hver og 5%. Oppbevares i romtemperatur før injeksjon.MERK: Bruk en 1 ml sprøyte til å ta opp 100 % trypanblått og filtrer gjennom et 0,22 mikrom sterilt filter før bruk. Fest den trukne kapillærnålen, heretter kalt en mikroinjeksjonsnål, til klemmemonteringsmikromanipulatoren stabilisert av et magnetfeste (oppsett vist i figur 2B). Pipette 2 μl injeksjonsoppløsning på en steril petriskål. Mens du observerer under mikroskopet, ta sakte opp 1-2 μL av denne løsningen i mikroinjeksjonsnålen ved hjelp av den lufttrykkssprøyten festet til mikromanipulatoren. Unngå bobler/opptak av bobler i mikroinjeksjonskanylen. Figur 2: Forberedelse av operasjonsområdet . (A) Oppsett av operasjonsområde inne i en ren benk. (B) Disseksjonsmikroskop og mikromanipulatoroppsett for en høyrehendt person. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 5. Utsette den kvinnelige reproduktive kanalen Bedøv en 6-8 uker gammel kvinnelig mus ved å administrere filtrert, fortynnet avertin (bedøvelse) intraperitonealt i en dose på 0,25-0,5 mg / g. Deretter administreres carprofen (forebyggende analgetika) subkutant i en dose på 5 mg/kg.MERK: Andre alternativer som kan brukes som bedøvelsesmiddel er isofluran eller ketamin / xylazin. Legg absorberende papir på en ren, oppvarmet pute/plate. Plasser deretter den bedøvede musen på dette oppvarmede absorberende papiret med dorsalsiden vendt opp. Påfør øye smøremiddel til hvert øye for å forhindre tørking under operasjonen.MERK: Bekreft at varmeputen/platen er litt varm å ta på ved å teste med håndbaken. Test for dyp bedøvelsesstans ved å klemme tåen på den bedøvede musen med et par tang. Fjern ryggpelsen rundt det potensielle snittstedet (plassering vist i figur 3A) og tørk av den nakne huden med antiseptisk middel. Bruk en rett butt tang til å klemme den nakne huden og lag et 1 cm langt snitt langs kroppens midtlinje ved hjelp av en steril skarp stump saks. Rengjør området rundt snittet med antiseptisk middel. Knip sammen og hold opp den ene siden av kuttstedet med et par sterile Ason-tanger. Deretter, ved hjelp av et par sterile buede takkede tang, skille huden forsiktig fra kroppsveggen, starter ved midtlinjesnittet og beveger seg sideveis. Finn fettputen under nyrene. Bruk en steril rett, butt tang, klem sammen kroppsveggen rett over fettputen. Lag et lite snitt i kroppsveggen ved hjelp av et par sterile skarpe spisse dissekerende saks, pass på å unngå blodkar. Mens du fortsatt klemmer kroppsveggen med rett, stump tang, setter du inn et par sterile, stumpe buede tanger i snittet og utvider snittet som er opprettet i kroppsveggen. Ta tak i den synlige fettputen med den stumpe buede tangen og trekk den ut av hullet for å avsløre eggstokken, ovidukten og livmoren. For å holde reproduksjonskanalen eksponert, klem fettputen med en steril bulldogklemme, som vist i figur 3B. 6. In vivo ovidukt injeksjon og elektroporering Plasser forsiktig det oppvarmede absorberende papiret og bedøvet mus med reproduksjonskanalen eksponert på scenen av et dissekerende mikroskop, slik at kanalen kan observeres. Et eksempel på visningen slik den er observert under mikroskopet er vist i figur 3B. Juster mikromanipulatoren slik at injeksjonsnålen med oppløsning også kan observeres under mikroskopet. Bruk et par sterile koniske ultrafine spisstang, hold regionen av ovidukten som skal injiseres stabil. Området som skal injiseres må være i tråd med retningen til mikroinjeksjonsnålen.NOTAT: Bruk bulldogklemmen som forankrer fettputen og reproduksjonskanalen for å forsiktig vri / flytte kanalen til en optimal posisjon, om nødvendig. Juster mikromanipulatoren for å punktere ovidukten med mikroinjeksjonsnålen, samtidig som ovidukten mates på nålen ved hjelp av de koniske ultrafine spisstangene. Beveg forsiktig mikroinjeksjonsnålen for å bekrefte at den er satt inn i ovidukten.MERK: Sett mikroinjeksjonsnålen inn i et rett segment i stedet for i et vendepunkt for den kveilede ovidukten for å forhindre flere punkteringer og lekkasje av injeksjonsoppløsning. Injiser sakte opptil 1 μL oppløsning i ovidukten, mens du observerer bevegelsen av den blå løsningen og utvidelsen av oviduktlumen under mikroskopet. Pass på at du ikke introduserer bobler i lumen. Representative bilder av ovidukter injisert med 100% trypanblå er vist i figur 3C,D. Fjern nålen fra ovidukten. Dekk området som skal målrettes med et stykke absorberende papir dynket i steril 1x PBS (fra trinn 3.3). Ta tak i det gjennomvåte papiret og området / regionen som skal målrettes med en elektrodepinsett (1 mm, 3 mm eller 5 mm, avhengig av størrelsen på regionen som skal målrettes) og trekk bort fra kroppen, før elektroporering ved hjelp av disse innstillingene på pulsgeneratoren / elektroporatoren: 30 V, tre pulser, 1 s intervall, 50 ms pulslengde, unipolar.MERK: Avstanden mellom elektrodene skal settes slik at elektrodene kan klemme seg på målområdet uten å deformere ovidukten. Den anbefalte avstanden er rundt 1 mm. Etter elektroporering, fjern absorberende papir og plasser musen (med oppvarmet absorberende papir under) tilbake på en varmepute. Løsne bulldog-klemmen og skyv forsiktig den eksponerte reproduksjonskanalen tilbake under kroppsveggen. Gjenta avsnitt 5 for å eksponere reproduksjonskanalen på den andre siden.MERK: Elektroporering er vellykket uavhengig av musens brunststadium så lenge lumen er fylt med løsningen. Dekk det eksponerte området med absorberende papir dynket i steril 1x PBS for å forhindre at det tørker ut, og klargjør deretter mikroinjeksjonsnålen for den andre injeksjonen ved å gjenta trinn 4.2 og 4.3.MERK: Bytt ut mikroinjeksjonskanylen etter behov. Unngå tørking av det eksponerte vevet ved å påføre sterilt 1x PBS når det er nødvendig. Gjenta trinnene ovenfor for å injisere og elektroporere ovidukten på motsatt side.MERK: Påfør øyesmøremiddelet etter behov under og etter operasjonen. Etter at begge oviduktene har blitt elektroporert og plassert tilbake under kroppsveggen, sutur eller stift dorsalsnittstedet. For suturering, bruk en hemostat for å gripe nålen til silkeflettede suturer (3/8 sirkel; måler: 5-0; nålstørrelse: 18 mm; gjengelengde: 75 cm). Klem og hold opp den ene siden av kuttstedet ved hjelp av et par sterile buede takkede tang, og bruk deretter hemostaten til å manipulere suturen for å lukke såret. Flytt musen inn i et rent bur som er plassert på toppen av en oppvarmet pute / plate (fra trinn 3.2) og overvåke til musen er aktiv. Administrer 5 mg/kg karprofen subkutant hver 24. time de neste 3 dagene og overvåk de neste 10 dagene. Figur 3: Eksponering av kvinnelige reproduksjonskanaler og mikroinjeksjon . (A) Plassering av midtlinjesnitt (vist som en gul linje) på dorsalsiden av en Rosa-LSLtdTomato-mus. (B) Eksponering av kvinnelige reproduktive kanaler. Fettputen ble klemt fast ved hjelp av en steril bulldog-klemme for å forankre kanalen og holde den eksponert. (C,D) Representative bilder av in vivo ovidukt injeksjon. En mikroinjeksjonsnål ble satt inn i distale ampuller (merket AMP), og filtrert 100% trypanblått ble injisert i oviduktlumen mens trakten ble eksponert (C). Representativt bilde av en dissekert ovidukt, som viser at injisert trypanblå oppløsning distribueres gjennom distale og proksimale oviduktlumen (D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

Figur 1 og figur 2 viser henholdsvis klargjøring av mikroinjeksjonsnål og oppsett av operasjonsområde for in vivo mikroinjeksjon og elektroporering av museovidukten. Under operasjonen ble den kvinnelige reproduksjonskanalen eksponert gjennom snitt laget i dorsalhuden (figur 3A) og kroppsveggen til en bedøvet Rosa-LSLtdTomato (Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)17 mus. En bulldogklemme ble klemt fast på fettputen over kanalen for å holde den eksponert og forankret (figur 3B). Injeksjonsoppløsning inneholdende PCS2 CreNLS-plasmider18 ved 400 ng/μL-konsentrasjon ble injisert i ampulla (merket AMP) til den kveilede ovidukten og fikk spre seg gjennom oviduktlumen (figur 3C,D). Selv om PCS2 CreNLS-plasmider ble brukt til å generere representative resultater i dette manuskriptet, kan den beskrevne metoden brukes med lett utskiftbare DNA / RNA / RNP i injeksjonsløsningen for CRISPR / Cas-mediert genredigering i museovidukten. Deretter ble 1 mm eller 3 mm pinsetttype elektroder plassert, slik at den distale ovidukten var mellom elektrodene for elektroporasjonsbasert levering. Ovidukter ble høstet 4 dager etter operasjonen og strukket ut ved å fjerne mesosalpinx for å visualisere elektroporasjonsspesifisitet. Ved bruk av elektroder av typen enten 1 mm eller 3 mm pinsett ble det målrettede området, merket med TdTomato, begrenset til det distale ovidukteepitelet (figur 4A,D). Størrelsen på dette målrettede området ble videre kontrollert ved hjelp av elektroder av forskjellige størrelser. Ved hjelp av 3 mm pinsett-type elektroder målrettet vi et mye større område av AMP (figur 4B, C), sammenlignet med å målrette bare den distale spissen, INF (figur 4E, F), ved hjelp av 1 mm pinsett-type elektroder. Disse høstede oviduktene ble fiksert, behandlet med en sukrosegradient og snittet ved hjelp av en kryostat for detaljerte analyser. Seksjoner ble motfarget med Hoescht 33342 og Phalloidin for å flekke kjernene og cytoskjelettet henholdsvis, så ble de avbildet ved hjelp av et punktskanning konfokalmikroskop. I det målrettede området ble elektroporerte celler, merket med TdTomato, tilfeldig fordelt mellom ikke-elektroporerte (TdTomato-ve) celler (figur 4G). I tillegg var elektroporerte celler begrenset til slimhinneepitelet og ikke funnet i underliggende stromale eller muskellag (figur 4G,H). Til slutt, for å bekrefte CRISPR-Cas-mediert genredigering, kan TdTomato + ve-celler isoleres ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for DNA-isolasjon og MiSeq-sekvensering12. Figur 4: Validering av vellykket in vivo injeksjon og elektroporering av ovidukt epitelceller, 4 dager etter operasjonen. (A-C) Elektroporering ved bruk av 3 mm pinsett-type elektroder. Ovidukten ble uncoiled ved å fjerne mesosalpinx for bedre visualisering av elektroporasjonsspesifisitet (A). Elektroporasjonsområdet, identifisert ved TdTomato-uttrykk, var begrenset til den distale ovidukten, merket AMP (B,C). (VG Nett) Elektroporering ved hjelp av 1 mm pinsett-type elektroder. Ovidukten ble uncoiled ved å fjerne mesosalpinx for bedre visualisering av elektroporasjonsspesifisitet (D). Elektroporasjonsområdet var begrenset til infundibulum (merket INF), oviduktens distale spiss (E,F). (G,H) Tverrsnitt av distale ovidukt 4 dager etter elektroporering med PCS2 CreNLS-plasmider. Elektroporerte celler merket med TdTomato (G) var begrenset til epitelmonolaget (H). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Avgjørende trinn i denne detaljerte protokollen er mikroinjeksjon av DNA / RNA / RNP-løsning i oviduktlumen og kontroll av elektroporasjonsstyrken og området. DNA/RNA/RNP-løsningslekkasje under mikroinjeksjon kan forårsake transfeksjon av uønskede områder/celler. For konsistent og effektiv elektroporering er det å foretrekke å fylle oviduktlumen med løsningen (figur 3C, D). Dette skyldes at området for elektroporering hovedsakelig styres av elektrodestørrelse og plassering. Svak elektroporering reduserer antall elektroporerte celler, og hard elektroporering kan forårsake elektroporering av uønskede celler eller forstyrre vevstrukturen. Antall elektroporerte celler kan varieres ved å justere DNA / RNA / RNP-løsningskonsentrasjonen eller elektroporasjonsparametrene. Men siden høye spenninger / varmeproduksjon under elektroporering kan skade vevet, bør disse parametrene testes før bruk på levende / bedøvede mus. Til slutt, på grunn av den krevende naturen til denne prosedyren, anbefales det å øve kanaleksponering og mikroinjeksjon på døde mus før du utfører denne operasjonen på levende / bedøvede mus.

Det er anerkjent at flere gener er involvert i kreftinitiering, og dermed krever rekapitulering av denne hendelsen multi-allelisk modifikasjon av flere gener. I tillegg er det også kjent at ikke alle celler er like utsatt for onkogene mutasjoner⁹. Kreftmodellering krever derfor spesifikke Cre-muselinjer for å oppnå tett kontroll over onkogene fornærmelser. Imidlertid forårsaker deres tilgjengelighet og spesifisitet ulike utfordringer, inkludert effekter i ikke-målrettede vev og dødelighet¹⁹. Videre medfører tradisjonelle G-GEMM-er høye kostnader for vedlikehold og krever tid for generering av muselinjer. Utviklingen av CRISPR / Cas9 genomredigeringsteknologi og forbedring av genlevering i spesifikke somatiske celler har gitt oss mulighet til å overvinne disse problemene. I denne protokollen presenterer vi en DNA/RNA/RNP leveringsmetode for somatisk genommanipulasjon som kan brukes til kreftmodellering, uten absolutt behov for spesifikke muselinjer¹². Ved å injisere DNA / RNA / RNP-løsninger i lumen og bruke forskjellige størrelser av pinsett-type elektroder for elektroporasjonsbasert levering, er begrensede områder av musens ovidukt slimhinneepitel målrettet (figur 4A-F). Dette er spesielt nyttig ved modellering av initiering av HGSC som stammer fra den distale enden av egglederen.

Den presenterte mikroinjeksjons- og in vivo-elektroporeringsmetoden er svært allsidig for å målrette vev / organer med lumen. Organparenchyma er også målrettet ved hjelp av denne metoden¹⁴. Virale leveringsmetoder, som lentivirale og adenovirale systemer, kan også brukes til lignende formål. Imidlertid er fordelene med elektroporering over virale leveringsmetoder: 1) multippel plasmidlevering i enkeltceller, 2) ingen begrensning på innsatsstørrelsen¹⁵ og 3) enkel kontroll av området og tidspunktet for levering. I tillegg kan målrettingsspesifisitet forbedres ved å bruke avstamningsspesifikke promotører. Dette er noen ganger vanskelig i virale systemer på grunn av grensen for viral emballasje.

Som det er naturen til elektroporering, er elektroporerte epitelceller tilfeldig ispedd sunne, uredigerte celler (figur 4G). Imidlertid kan denne mosaikken i genmodifiserte og umodifiserte celler være fordelaktig for å studere kreftinitiering, da den rekapitulerer den sporadiske karakteren av tidlig kreftinitiering i et immunkompetent mikromiljø. Frekvensen av elektroporerte celler kan justeres ved å variere DNA / RNA / RNP-løsningskonsentrasjonene og / eller elektroporasjonsparametrene. Ved å bruke CRISPR-Cas-mediert genredigering i kombinasjon med den presenterte protokollen, er det enkelt å screene flere gener og generere heterogene mønstre av mutasjoner / alleliske kombinasjoner i målrettede gener; Dette er spesielt nyttig ved modellering av kreft som presenterer et betydelig antall genomiske endringer som HGSCs^20,21. Videre, ved å sekvensere målrettede gener under kreftprogresjon, er det mulig å følge in vivo klonal evolusjon av svulster og metastaser i immunkompetente mus¹².

Materials

0.22 µm sterile filter unit	LifeGene	SF0.22PES
1 mL syringe	Terumo Medical Corportation	SS-01T
1 mm tweezer-type electrodes	BEX CO., LTD	LF650P1
3 mm tweezer-type electrodes	BEX CO., LTD	LF650P3
30G x 1/2 Needle	BD	305106	Needle is attached to the 1 mL syringe when using injectable anesthetic or analgesic.
Adson forceps	Fisher Scientific	10-000-451
Air-pressured syringe	BD	B302995	Attached to the micromanipulator; as shown in Figure 2B
Analgesic	–	–	Carprofen, dose: 5mg/kg.
Antiseptic	Cardinal Health	OMEL0000017	Baxedin: 2% chlorhexidine in 70% isopropyl alcohol
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) – Anesthetic	Sigma Aldrich	T48402-25G
Clamp mount micromanipulator	AD Instruments	MM-33
Curved serrated forceps	Fisher Scientific	NC0696845
Dissecting microscope	Zeiss	SteREO Discovery.V8	Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Attached KL 200 LED for top light, labelled as light source in Figure 2B.
Eye lubricant	Alcon	–	Systane ointment (Lubricant eye ointment)
Glass capillary needles	Sutter Instrument Co.	B100–50-10	Outside diameter: 1 mm, inside diameter: 0.5 mm, length: 10 cm
Hartman hemostats	Fisher Scientific	50-822-711
Heating pad/disc	–	–	SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad was used in this protocol. Microwave for 2-5min, and test with back of gloved hand.
Magnetic Mount for micromanipulator	AD Instruments	MB-B	Used to keep the clamp mount micromanipulator stable and upright during injection.
Micro bulldog clamp	Fisher Scientific	50-822-230	3 cm
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	P-97	P-97 Flaming/Brown type micropipette puller. Program used: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70
Petri dish	Fisher Scientific	263991	Autoclaved/sterile glass petridishes can also be used.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Bio Basic Inc.	PD8117	10X PBS was diluted to 1X with DI water. Autoclave before use.
Pulse generator/Electroporator	BEX CO., LTD	CUY21 EDIT II	Electroporation settings: 30 V, 3 pulses, 1 s interval, P. length = 50 ms, unipolar
Rosa-LSLtdTomato mice	The Jackson Laboratory	7914	Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J
Sharp-blunt dissection scissors	Fisher Scientific	28251
Sharp-pointed dissecting scissors	Fisher Scientific	SDI130
Shaver	–	–	Hair removal cream can also be used.
Silk braided sutures	Ethicon	682G	3/8 circle, gauge: 5-0, needle size: 18 mm, thread length: 75 cm. Staples can also be used.
Tapered ultrafine tip forceps	Fisher Scientific	12-000-122
Thin absorbent paper	Kimberly-Clark Professional	34120	Kimwipes
Trypan blue	STEMCELL Technologies	7050	Filtered using 0.22 µm sterile filter before use for microinjection.