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Biologie

Verlängerung der Lebensdauer von Neutrophilen mit CLON-G und einem In-vitro-Spontantod-Assay

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65132
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Experimental Hematology, National Clinical Research Center for Blood Diseases, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology & Blood Diseases Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Tianjin Institutes of Health Science, 3Sichuan Provincial People’s Hospital,University of Electronic Science and Technology of China, 4Haihe Laboratory of Cell Ecosystem,Tianjin Medical University, 5Joint Program in Transfusion Medicine, Department of Pathology, Harvard Medical School; Division of Blood Bank, Department of Laboratory Medicine, The Stem Cell Program, Boston Children’s Hospital,Dana-Farber /Harvard Cancer Center

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von CLON-G, um die Lebensdauer der Neutrophilen auf mehr als 5 Tage zu verlängern, und bietet ein zuverlässiges Verfahren zur Beurteilung des Neutrophilentods mit Durchflusszytometrie und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie.

Abstract

Die durchschnittliche Lebensdauer eines Neutrophilen beträgt weniger als 24 h, was die Grundlagenforschung an Neutrophilen und die Anwendung von Neutrophilenstudien einschränkt. Unsere bisherigen Forschungen zeigten, dass mehrere Signalwege den spontanen Tod von Neutrophilen vermitteln könnten. Es wurde ein Cocktail entwickelt, der gleichzeitig auf diese Signalwege abzielt, Caspasen-lysosomale Membranpermeabilisierung-Oxidationsmittel-Nekroptose-Hemmung sowie Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (CLON-G), der die Lebensdauer der Neutrophilen auf mehr als 5 Tage verlängerte, ohne die Neutrophilenfunktion signifikant zu beeinträchtigen. Gleichzeitig wurde ein zuverlässiges und stabiles Protokoll zur Beurteilung und Bewertung des Neutrophilentods entwickelt. In dieser Arbeit zeigen wir, dass CLON-G die Lebensdauer von Neutrophilen in vitro auf mehr als 5 Tage verlängern kann, und wir zeigen die Verlängerung der Lebensdauer von Neutrophilen mit FACS und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Dieser Bericht stellt Verfahren zur Herstellung von CLON-G vor und stellt einen in vitro Spontantodtest von Neutrophilen vor, der für die Untersuchung von Neutrophilen und für die anschließende Untersuchung des Neutrophilentods verwendet werden kann und somit eine zuverlässige Ressource für die Neutrophilengemeinschaft darstellt.

Introduction

Es ist bekannt, dass Neutrophile ein Arsenal an reichlich zytoplasmatischen Granula, Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH)-Oxidase, antimikrobiellen Enzymen und verschiedenen Organellen enthalten, die sich gegen eindringende Mikroben verteidigen. Darüber hinaus sind sie sehr beweglich und die ersten Zellen, die an die Entzündungsstelle rekrutiert werden, was bedeutet, dass Neutrophile die erste Verteidigungslinie des angeborenen Immunsystems sind 1,2. Die Granulozyten-Transfusionstherapie ist daher zu einer vielversprechenden klinischen Behandlung für neutropeniebedingte Infektionen geworden, um die Immunität der neutrophilen Granulozyten vorübergehend zu stärken 3,4,5. Neuere Entdeckungen haben deutlich gezeigt, dass Neutrophile in vielen physiopathologischen Szenarien auch als vielschichtige Effektoren fungieren6. Die durchschnittliche Lebenserwartung eines Neutrophilen beträgt weniger als 24 Stunden, so dass die Grundlagenforschung an Neutrophilen und die Anwendung von Neutrophilenstudien aufgrund der Einschränkungen im Zusammenhang mit stabiler Genmanipulation und Langzeitlagerung enorm schwierig sind 7,8,9,10,11 . Es gibt einige Zelllinien, die teilweise einige neutrophile Funktionen aufweisen können, wie z. B. HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 und induzierte pluripotente Stammzellen12. Diese Zelllinien können eine effektive Genom-Editierung und Kryokonservierung erreichen. Sie unterscheiden sich jedoch immer noch recht stark von den primären Neutrophilen und können daher die Funktionen der Neutrophilen nicht originalgetreu rekapitulieren13. Daher stützt sich der größte Teil der Forschung auf diesem Gebiet immer noch auf frisch isolierte primäre Neutrophile. Das Feld beruht immer noch auf der Erzeugung teurer und zeitaufwändiger bedingter Knock-out-Mäuse, um bestimmte Genfunktionen in Neutrophilen zu untersuchen, aber derzeit gibt es keine menschlichen Modelle.

Nachdem wir unsere Anstrengungen unternommen haben, um die heterogenen Prozesse zu erforschen, die am Tod von Neutrophilen beteiligt sind, und die vielfältigen Signalwege, die diese Prozesse regulieren14,15, wurde kürzlich über eine neue Behandlung namens CLON-G (Caspasen-lysosomale Membranpermeabilisation-Oxidationsmittel-Nekroptose-Hemmung plus Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor) berichtet 16. CLON-G besteht aus Q-VD-oph (Chinolyl-Valyl-O-methylaspartyl-[-2,6-difluorphenoxy]-methylketon), Hsp70 (Hitzeschockprotein 70), DFO (Deferoxamin), NAC (N-Acetylcystein), Nec-1s (Necrostatin-1s) und G-CSF (Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor). Der Spontantod von Neutrophilen wird durch mehrere Wege vermittelt, darunter Apoptose, Nekroptose und Pyroptose. Q-VD-oph hemmt die Apoptose von Neutrophilen als Pan-Caspase-Inhibitor, indem es auf Caspase 1, Caspase 3, Caspase 8 und Caspase 9 abzielt17. Die Nekroptose der Neutrophilen ist von einem Signalweg abhängig, an dem die Rezeptor-interagierende Proteinkinase-1 (RIPK1) und das gemischte Kinase-Domänen-ähnliche Protein (MLKL) beteiligt sind18. Als RIPK1-Inhibitor hemmen Nec-1s die Nekroptose von Neutrophilen. Hsp70 und DFO können die lysosomale Membranpermeabilisierung (LMP) hemmen, was die Apoptose der neutrophilen Granulozyten19 und die Pyroptose20 induzieren könnte. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine wichtige Rolle beim Tod von Neutrophilen, indem sie LMP19 und Apoptose21 vermitteln und Überlebenssignale22 hemmen. Als Antioxidans, das die Akkumulation von ROS reduzieren kann, verzögert NAC den Tod von Neutrophilen. Als Wachstumsfaktor aktiviert G-CSF die Überlebenssignale der neutrophilen Granulozyten und hemmt die Calpain-induzierte Apoptose23,24. Durch die gleichzeitige Ausrichtung auf mehrere spontane Todeswege der Neutrophilen kann die Lebensdauer der Neutrophilen effektiv auf mehr als 5 Tage verlängert werden, ohne ihre Funktion zu beeinträchtigen. Die CLON-G-Behandlung erweitert die Möglichkeiten der Konservierung, des Transports und der Genmanipulation von Neutrophilen, was die Forschung in der Gemeinschaft der Neutrophilen beschleunigen kann. In der Zwischenzeit können die derzeit zugelassenen Protokolle für Zelltod-Assays auf der Grundlage des Wissens über den Tod von Neutrophilen unerwartete Schäden an Neutrophilen verursachen14, so dass diese Protokolle verfeinert wurden, um für Neutrophilenstudien besser geeignet zu sein. Dieser Bericht enthält detaillierte Protokolle für die Kultivierung von Neutrophilen mit CLON-G und einen In-vitro-Zelltodtest von Maus-Neutrophilen mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzbildgebung. CLON-G ist sowohl auf Maus- als auch auf menschliche Neutrophile wirksam; Die Mausproben werden hier jedoch demonstriert, um dieses Protokoll zu vereinfachen. Die Konzentration von NAC beträgt 1 mM für Maus-Neutrophile und 10 μM für humane Neutrophile. Hsp70 ist speziesspezifisch und sollte daher entsprechend der Quelle der Neutrophilen eingesetzt werden. Bei diesem Protokoll spielt es keine Rolle, ob und wie Neutrophile aus peripherem Blut oder Knochenmark isoliert werden.

Für die vorliegende Studie wurden Neutrophile aus dem Knochenmark der Maus isoliert, um genügend Neutrophile für die Experimente zu erhalten, da etwa 1 x 10 7-1,5 x 107 Neutrophile aus dem Knochenmark gewonnen werden können, während nur 1 x 10 6 Neutrophile aus dem peripheren Blut einer einzelnen 8-12 Wochen alten C57BL/6-Maus (beiderlei Geschlechts) isoliert werden können. Es wurde eine Gradientenzentrifugation durchgeführt, um eine mögliche Beschädigung und Aktivierung durch die mechanische Stimulation der FACS-Sortierung oder MACS-Sortierung zu vermeiden.

Protocol

Das Boston Children’s Hospital and State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) Animal Care and Use Committee genehmigte und überwachte alle Verfahren. Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der Kultivierung von Neutrophilen mit CLON-G und dem In-vitro-Todestest . 1. Verlängerung der Lebensdauer von Neutrophilen mit CLON-G HINWEIS: Alle genannten Vorgänge und Materialien müssen steril sein. Stellen Si…

Representative Results

Die Wright-Giemsa-gefärbte Morphologie (Abbildung 2A-D) und die FACS-Phänotypen (Abbildung 2E-J) der mit CLON-G behandelten Neutrophilen wurden nicht beeinflusst. Die Viabilität der mit CLON-G behandelten Neutrophilen nach 24 h betrug etwa 90%+, basierend auf der durchflusszytometrischen Analyse (Abbildung 3) und den Fluoreszenzbild-Assays (A…

Discussion

Neutrophile Granulozyten spielen eine wichtige Rolle bei der angeborenen und adaptiven Immunität, und ihre Homöostase ist streng reguliert. Neutrophile Granulozyten sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im peripheren Blut des Menschen und haben einen robusten und schnellen Umsatz. Ein gesunder Erwachsener kann täglich 1 x 109 Neutrophile/kg aus dem Knochenmark freisetzen28. Das Absterben der Neutrophilen ist daher zu einem der rätselhaften Rätsel auf diesem Gebiet geworde…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dieses Projekt wurde vom Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), dem Innovationsfonds für medizinische Wissenschaften der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften (CAMS) (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), dem Sonderforschungsfonds für zentrale Universitäten, dem Peking Union Medical College (3332022062) und dem Science and Technology Support Program der Provinz Sichuan (NO. 2021YJ0480) unterstützt.

Materials

0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4612 Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube LABSELECT MCT-001-150 Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-15 Lab consumable.
24 well cell culture plate Falcon 351147 Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-50 Lab consumable.
BD LSRII BD Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich C4901 Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope Perkinelmer UltraVIEW VOX Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate NEST 801001-20mm Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads Thermo Fisher C36950 Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO Sigma Aldrich D9533 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO) Sigma Aldrich D2650 Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum Gibco 10099141C Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V BD 51-65874X Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70 Abcam ab113187 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC Sigma Aldrich A9165 Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s EMD Millipore 852391-15-2 Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS) Gibco 15070063 Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI) BioLegend 421301 For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph Selleck chem S7311 Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) Chugai Pharma China GRANOCYTE Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes Falcon 100-0102 Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640 Gibco C11875500BT Component of neutrophil culture basic medium.
Saline LEAGENE R00641 Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH) FENG CHUAN 13-011-00029 pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution Solarbio G1020 Neutrophil cytospin staining.
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References

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Fan, Y., Teng, Y., Liu, F. t., Ma, F., Hsu, A. Y., Feng, S., Luo, H. R. Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay. J. Vis. Exp. (195), e65132, doi:10.3791/65132 (2023).
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