Her beskriver vi en protokoll, den utvidede endotelcellekulturmetoden (EECM), som tillater differensiering av pluripotente stamceller til hjernens mikrovaskulære endotelcelle (BMEC)-lignende celler. Disse cellene viser endotelcelleadhesjonsmolekyluttrykk og er dermed en human blod-hjernebarrieremodell egnet til å studere immuncelleinteraksjoner in vitro.
Dysfunksjon av blod-hjernebarriere (BBB) er et patologisk kjennetegn på mange nevrodegenerative og nevroinflammatoriske sykdommer som påvirker sentralnervesystemet (CNS). På grunn av den begrensede tilgangen til sykdomsrelaterte BBB-prøver, er det fortsatt ikke godt forstått om BBB-funksjonsfeil er årsaksmessig for sykdomsutvikling eller snarere en konsekvens av den nevroinflammatoriske eller nevrodegenerative prosessen. Humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSCs) gir derfor en ny mulighet til å etablere in vitro BBB-modeller fra friske donorer og pasienter, og dermed studere sykdomsspesifikke BBB-karakteristika fra individuelle pasienter. Flere differensieringsprotokoller er etablert for å utlede hjernemikrovaskulære endotelceller (BMEC)-lignende celler fra hissc. Vurdering av det spesifikke forskningsspørsmålet er obligatorisk for riktig valg av den respektive BMEC-differensieringsprotokollen. Her beskriver vi den utvidede endotelcellekulturmetoden (EECM), som er optimalisert for å skille hiPSCs i BMEC-lignende celler med en moden immunfenotype, noe som tillater studiet av immuncelle-BBB-interaksjoner. I denne protokollen differensieres hissc først til endoteliale stamceller (EPC) ved å aktivere Wnt/β-catenin-signalering. Den resulterende kulturen, som inneholder glatte muskellignende celler (SMLC), blir deretter sekvensielt passasjert for å øke renheten av endotelceller (EC) og for å indusere BBB-spesifikke egenskaper. Samkultur av EECM-BMEC med disse SMLC-ene eller betinget medium fra SMLC muliggjør reproduserbart, konstitutivt og cytokinregulert ekspresjon av EC-adhesjonsmolekyler. Det er viktig at EECM-BMEC-lignende celler etablerer barriereegenskaper som kan sammenlignes med primære humane BMECer, og på grunn av deres uttrykk for alle EC-adhesjonsmolekyler, er EECM-BMEC-lignende celler forskjellige fra andre hiPSC-avledede in vitro BBB-modeller. EECM-BMEC-lignende celler er dermed den valgte modellen for å undersøke den potensielle effekten av sykdomsprosesser på nivået av BBB, med innvirkning på immuncelleinteraksjon på en personlig måte.
Den nevrovaskulære enheten (NVU) i sentralnervesystemet (CNS) består av de høyt spesialiserte mikrovaskulære endotelceller (ECs), pericytter innebygd i endotelkjellermembranen samt parenkymal kjellermembran og astrocyttens endeføtter1. Innenfor NVU er hjernens mikrovaskulære endotelceller (BMEC) nøkkelkomponentene som danner blod-hjernebarrieren (BBB). BMEC danner komplekse og kontinuerlige tette kryss og har ekstremt lav pinocytotisk aktivitet sammenlignet med mikrovaskulære ECs i perifere organer, noe som gjør at BBB kan hemme den frie paracellulære diffusjonen av vannløselige molekyler i CNS. Ekspresjonen av spesifikke tilstrømningstransportører og efflukspumper av BMECs sikrer opptak og eksport av henholdsvis næringsstoffer og skadelige molekyler fra CNS2. I tillegg kontrollerer BBB strengt immuncelleinngangen til CNS ved å uttrykke lave nivåer av endoteladhesjonsmolekyler som er avgjørende for immuncelletrafikk i CNS3. Under fysiologiske forhold er ekspresjonsnivåene av adhesjonsmolekyler på overflaten av BMEC, slik som intercellulært adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) og vaskulært celleadhesjonsmolekyl-1 (VCAM-1), lave, men disse nivåene øker i noen nevrologiske lidelser2. Morfologisk og funksjonell nedbrytning av BBB er rapportert i mange nevrologiske sykdommer, som hjerneslag4, multippel sklerose (MS)5 og flere nevrodegenerative sykdommer 6,7,8. Detaljert undersøkelse av de cellulære og molekylære egenskapene til BMEC under både fysiologiske og patologiske forhold er en tilnærming til å identifisere nye terapeutiske strategier som retter seg mot BBB.
Inntil nylig ble primære eller udødeliggjorte BMEC-er for mennesker og gnagere brukt til å studere BBB. Hvorvidt konklusjoner basert på dyremodeller av BBB er lett anvendelige for den menneskelige BBB er imidlertid uklart, siden uttrykket av flere viktige molekyler, inkludert adhesjonsmolekyler og løsemiddelbærerproteiner, er forskjellig mellom mennesker og gnagere 9,10. Selv om menneskelige BMEC-linjer som hCMEC / D3 uttrykker passende nivåer av adhesjonsmolekyler11, har disse udødeliggjorte BMECene generelt ikke komplekse tette kryss og robuste barriereegenskaper12. Primære menneskelige BMECer er nyttige for å studere barrierefunksjoner13, men de er ikke lett tilgjengelige for alle forskere. Videre kan primære BMECs fra pasienter være vanskelig å få tak i siden de må samles inn gjennom en hjernebiopsi eller kirurgi som bare utføres under spesifikke kliniske forhold.
Nylige fremskritt innen stamcelleteknologi har gjort det mulig å differensiere ulike humane celletyper, som oppstår fra stamcellekilder som humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSCs). De hiPSC-avledede modellene lar oss etablere patofysiologiske modeller ved hjelp av pasientavledede prøver. Flere hiPSC-avledede celletyper kan kombineres for å etablere autologe kokulturer eller organoider som bedre etterligner fysiologiske forhold. Flere mye brukte protokoller 14,15,16,17,18,19 kan brukes til å differensiere hiPSC-avledede BMEC-lignende celler som har robuste diffusjonsbarriereegenskaper med ekspresjonen av BBB-spesifikke transportører og efflukspumper, og er nyttige for å studere paracellulær diffusjon av små molekyler, molekylære transportmekanismer og medikamentlevering til hjernen 20,21. Tidligere studier har imidlertid vist at mye brukte hiPSC-avledede BMEC-lignende celler mangler ekspresjon av viktige endoteladhesjonsmolekyler, inkludert VCAM-1, seliner og ICAM-2, som er ansvarlige for å formidle interaksjoner mellom immunceller og BBB22. Videre har tidligere hiPSC-deriverte BMECer blitt rapportert å vise blandede endotel- og epitelegenskaper på transkripsjonsnivå23. Derfor utviklet vi den utvidede endotelcellekulturmetoden (EECM), en ny protokoll som tillater differensiering av hissc i BMEC-lignende celler som ligner primære humane BMECer med hensyn til morfologi, barriereegenskaper og endoteladhesjonsmolekyluttrykk. Denne protokollen beskriver detaljerte metodologiske prosedyrer for å skille hiPSCs til BMEC-lignende celler som viser en moden immunfenotype.
Kritiske punkter og feilsøking
Før man starter EPC-differensiering, bør forskerne forsikre seg om at det ikke har forekommet spontane celledifferensieringshendelser i hiPSC-kulturene. Fraværet av spontant differensierte celler og bruk av rene hiPSC-kolonier er kritisk for å oppnå reproduserbare resultater. HiPSC-såtettheten på dag -3 er viktig for å oppnå en høy renhet av CD31+ EPC etter MACS. Såtettheten for hver hiPSC-linje og hver passasje kan kreve optimalisering. Avhengig av hiPSC-linjen og passasjenummeret, kan såtettheten variere mellom 75 x 10 3 til 400 x 10 3 hiPSCs per brønn på en 12-brønnsplate (20-100 x 103 / cm2). Minste tetthetskontrollpunkt for hiPSCs er celletettheten på dag 2. HiPSCene skal nå 100 % samløp senest innen dag 2. Hvis hisscene ikke er sammenflytende innen dag 2, vil renheten til CD31+ EPC etter MACS vanligvis være ganske lav. I dette tilfellet kan hiPSC-såingstettheten økes. Hvis et stort antall differensieringsceller løsner fra platen rundt dag 3 til dag 5, kan den opprinnelige hisc-såingstettheten reduseres. 7-8 μM CHIR99021 er etter vår erfaring den optimale konsentrasjonen for hiPSCs-linjene som brukes her, men konsentrasjonen må kanskje optimaliseres for andre hiPSC-linjer som kan reagere annerledes på inhibitorbehandlingen. Renheten til CD31+ EPC bør bekreftes før og etter MACS. Før du fortsetter med MACS, bør den forhåndssorterte celleblandingen være >10% CD31+ celler. CD31+-celleprosenter på <6 % resulterer vanligvis i <80 % EPC etter MACS. Optimalisering av den opprinnelige såtettheten og/eller CHIR99021-konsentrasjonen er nødvendig i denne situasjonen.
For vellykket selektiv passering og generering av rene EC-monolag, er renheten etter MACS til CD31+ EPC-er kritisk. Hvis renheten etter MACS er 95%. EPC-såtettheten på kollagenbelagte plater bør optimaliseres i henhold til hiPSC-linjen for å oppnå 100% sammenløp innen 3-7 dager. Å vente til EC er 100% sammenflytende vil vanligvis føre til vellykket selektiv passasje. Men selv for 100% sammenflytende EC-er, løsner noen hiPSC-linjers SMLC-er også tidlig. I slike tilfeller kan selektiv passasjering ved lavere konfluens (f.eks. ≤80 %) være effektivt. Hvis noen SMLC-er løsner tidligere enn EC-er, kan EC-ene ofte ikke reddes fra den blandede EC-SMLC-populasjonen. I dette tilfellet kan det være nyttig å forkorte aktiveringstiden for dissosiasjonsreagenset i passerende EC og repeterende selektiv passasje. Bruken av et kommersielt dissosiasjonsreagens i stedet for trypsin som dissosiasjonsreagens er gunstig for selektiv passasje, da trypsin ikke tillater separat løsrivelse av EC og SMLC. Våre permeabilitetsanalyser ved bruk av sporstoffer for små molekyler og testing av tette koblings- og adhesjonsmolekyluttrykksnivåer indikerer at EPC, EECM-BMEC-lignende celler og SMLC kan lagres i flytende nitrogen i minst 2 år.
Betydningen og begrensningene ved metoden
Metoden skiller CD31+ EPC fra hiPSC ved bruk av kjemiske GSK-3-hemmere for å aktivere Wnt/β-catenin-signalering. Etter positivt utvalg av CD31+ EPC av MACS, dyrkes EPC i et definert endotelmedium som fremmer differensiering i blandede endotel- og SMLC-populasjoner. Selektiv passering av disse blandede populasjonene med forskjellige klebende egenskaper tillater separasjon av EC fra SMLC. Etter en eller to passasjer viser EECM-BMEC-lignende celler barriereegenskaper og ekspresjonen av endoteladhesjonsmolekyler som rekapitulerer de primære humane BMECene. Samkultur med SMLC eller deres supernatanter induserer cytokinindusert ekspresjon av VCAM-1.
In vivo opprettholder BBB CNS-homeostase ved å etablere lav paracellulær og transcellulær permeabilitet av molekyler, gjennom transport av næringsstoffer via spesifikke transportører og kontroll av immuncelletrafikk inn i CNS. For studier av BBB er en egnet modell som viser de respektive molekylene og funksjonene av interesse avgjørende. Produksjon av EECM-BMEC-lignende celler ved bruk av definerte reagenser og prøver fra pasienter eller friske personer gir en skalerbar human BBB-modell. Fordelene med en modell som bruker EECM-BMEC-lignende celler over andre BBB-modeller er: 1) en morfologi og endotelial transkriptomprofil30 som ligner den for primære humane BMECer; 2) tilstedeværelsen av modne tette kryss; 3) ønskelige barriereegenskaper; og 4) det robuste uttrykket av endoteladhesjonsmolekyler, inkludert ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, E- og P-selektin, CD99, melanomcelleadhesjonsmolekyl (MCAM) og aktivert leukocyttcelleadhesjonsmolekyl (ALCAM)22. Dermed er denne modellen spesielt nyttig for å studere interaksjoner mellom immunceller og BMEC. Selv om permeabiliteten til små molekylsporstoffer er høyere for EECM-BMEC-lignende celler enn det som tidligere er rapportert for iPSC-avledede BMEC-lignende celler14,15, sammenligner barriereegenskapene ganske godt med de som er beskrevet for primære humane BMECer. Denne likheten indikerer at EECM-BMEC-lignende celler sannsynligvis vil være en god in vitro-modell av BBB. E-selektinekspresjon på EECM-BMEC-lignende celler under fysiologiske forhold må tas i betraktning ved bruk av denne modellen for å studere ikke-betente BBB som mangler konstitutivt E-selektinuttrykk in vivo31. I vår tidligere studie viste vi at EECM-BMEC-lignende celler kunne fenokopiere BBB, som observert i hjernen til MS-pasienter med hensyn til forstyrrede stramme kryss. Dette resulterer i en høyere permeabilitet av små molekyler og økt ekspresjon av funksjonelt adhesjonsmolekyl, som medierer økt vedheft og transmigrasjon av immunceller over BMEC-lignende celler32. Videre viste vi at aktivering av Wnt / β-catenin-signalering kan forbedre forstyrrelsen av stramme kryss og økt VCAM-1-uttrykk i MS-avledede EECM-BMEC-lignende celler32. Disse resultatene indikerer at modellen faktisk er nyttig for å studere BBBs rolle i nevroimmunologiske sykdommer, som MS.
Samlet sett er EECM-BMEC-lignende celler et lovende verktøy for grundig forståelse av patofysiologiske mekanismer på BBB-nivå og som et verktøy for å utvikle nye terapeutiske mål for BBB-stabilisering. I fremtiden kan modellen brukes til å studere BBB-dysfunksjon i et bredere spekter av sykdommer og kan åpne veier for nye terapeutiske tilnærminger.
The authors have nothing to disclose.
HN ble støttet av Uehara Memorial Foundation, et ECTRIMS Postdoctoral Research Exchange Fellowship, JSPS under Joint Research Program implementert i tilknytning til SNSF (JRPs) Grant nr. JPJSJRP20221507 og KAKENHI Grant No. 22K15711, JST FOREST Program (tilskuddsnummer JPMJFR2269, Japan), YOKOYAMA Foundation for Clinical Pharmacology Grant nr. YRY-2217, ICHIRO KANEHARA FOUNDATION, Narishige Neuroscience Research Foundation, NOVARTIS Foundation (Japan) for fremme av vitenskap, og YAMAGUCHI UNIVERSITY FUND. BE ble støttet av Swiss MS Society og Swiss National Science Foundation (tilskudd 310030_189080 og ZLJZ3_214086) og strategisk japansk-sveitsisk vitenskap og teknologi program (SJSSTP) tilskudd IZLJZ3_214086.
0.22 mm Syringe filter | TPP | 99722 | |
15 mL Centrifuge tube | Falcon | 352196 | |
40 μm Falcon cell strainer | Falcon | 352340 | |
5 mL Round-bottom tube | SPL | 40005 | |
50 mL Centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
96-Well plate, round bottom | SPL | 34096 | |
Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-500ml | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634 | |
All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
B-27 Supplement (503), serum free | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
Bovine serum albumin (BSA), 7.5% in dPBS | Sigma-Aldrich | A8412 | |
CellAdhere Dilution Buffer | STEMCELL Technologies | ST-07183 | |
CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
Chamber slides | Thermo Fischer Scientific | 178599 | |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | |
Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Corning tissue culture plates (12-well) | Corning | 3512 | |
Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
Cryo tube innercap 2.0 mL | Watson | 1396-201S | |
Dimethylsulfoxide (DMSO), sterile | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM (13), [+] 4.5 g/L D-glucose, [-] L-glutamine, [-] pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 31053-028 | |
Dulbecco’s (d) PBS (without calcium, magnesium) | Thermo Fisher | 14190250 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/nutrient mixture F-12 (DMEM-F12) | Thermo Fischer Scientific | 11320074 | |
EasySepFITC Positive Selection Kit II | STEMCELL Technologies | 18558 | |
EasySepMagnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid Solution0.02% in DPBS | Sigma | E8008-100ML | |
Fetal Bovine Serum, qualified | Thermo Fischer Scientific | 10270106 | |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Ficoll-Paque PLUS | Sigma-Aldrich | GE17144002 | |
FIJI software (Version 2.0.0) | Image J, USA | ||
FlowJo version10 | BD | ||
Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fischer Scientific | 35050-061 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
HCL | Sigma-Aldrich | H1758 | |
HEPES buffer solution | Thermo Fischer Scientific | 15630-056 | |
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) | Thermo Fischer Scientific | 11111-044 | |
Human fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Tocris | 233-FB-500 | |
iPS human induced pluripotent stem cells | Riken RBC | HPS1006 | |
Kanamycin Sulfate (100x) | Thermo Fischer Scientific | 15160-047 | |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
L-Glutamine 200 mM (1003) | Thermo Fischer Scientific | 25030-024 | |
Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | |
MEM NEAA (1003) | Thermo Fischer Scientific | 11140-035 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | |
mTeSR Plus-cGMP | STEMCELL Technologies | ST-100-0276 | |
mTeSR1 complete kit (basal medium plus 53 supplement) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
Paraformaldehyde | Millipore | 104005 | |
Pen Strep | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | |
Recombinant Human IFN-gamma Protein | R&D Systems | 285-IF-100 | |
Recombinant Human IL-2 | BD Biosciences | 554603 | |
Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
RPMI medium 1640 | Thermo Fischer Scientific | 21875-034 | |
Scalpel | FEATHER | 2975-11 | |
Skim milk | BD Biosciences | 232100 | |
Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | 71290 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 11360-039 | |
Transwells, PC Membrane, 0.4 mm, 12 mm, TC-Treated | Corning | 3401 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | 93362 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Vitronectin XF | STEMCELL Technologies | 078180 | |
Water, sterile, cell culture | Sigma-Aldrich | W3500 |