Her beskriver vi en protokol, den udvidede endotelcellekulturmetode (EECM), der tillader differentiering af pluripotente stamceller til hjernens mikrovaskulære endotelcelle (BMEC) -lignende celler. Disse celler viser endotelcelleadhæsionsmolekyleekspression og er således en human blod-hjerne-barrieremodel, der er egnet til at studere immuncelleinteraktioner in vitro.
Blod-hjerne barriere (BBB) dysfunktion er et patologisk kendetegn ved mange neurodegenerative og neuroinflammatoriske sygdomme, der påvirker centralnervesystemet (CNS). På grund af den begrænsede adgang til sygdomsrelaterede BBB-prøver er det stadig ikke godt forstået, om BBB-funktionsfejl er årsagssammenhæng for sygdomsudvikling eller snarere en konsekvens af den neuroinflammatoriske eller neurodegenerative proces. Human inducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er) giver derfor en ny mulighed for at etablere in vitro BBB-modeller fra raske donorer og patienter og dermed studere sygdomsspecifikke BBB-karakteristika fra individuelle patienter. Flere differentieringsprotokoller er blevet etableret til udledning af hjernemikrovaskulære endotelceller (BMEC) -lignende celler fra hiPSC’er. Overvejelse af det specifikke forskningsspørgsmål er obligatorisk for det korrekte valg af den respektive BMEC-differentieringsprotokol. Her beskriver vi den udvidede endotelcellekulturmetode (EECM), som er optimeret til at differentiere hiPSC’er til BMEC-lignende celler med en moden immunfænotype, hvilket muliggør undersøgelse af immuncelle-BBB-interaktioner. I denne protokol differentieres hiPSC’er først til endotelstamceller (EPC’er) ved at aktivere Wnt / β-catenin-signalering. Den resulterende kultur, som indeholder glatte muskellignende celler (SMLC’er), passeres derefter sekventielt for at øge renheden af endotelceller (EC’er) og for at inducere BBB-specifikke egenskaber. Co-kultur af EECM-BMEC’er med disse SMLC’er eller konditioneret medium fra SMLC’er muliggør reproducerbar, konstitutiv og cytokinreguleret ekspression af EC-adhæsionsmolekyler. Det er vigtigt, at EECM-BMEC-lignende celler etablerer barriereegenskaber, der kan sammenlignes med primære humane BMEC’er, og på grund af deres ekspression af alle EC-adhæsionsmolekyler er EECM-BMEC-lignende celler forskellige fra andre hiPSC-afledte in vitro BBB-modeller. EECM-BMEC-lignende celler er således den valgte model til undersøgelse af den potentielle indvirkning af sygdomsprocesser på BBB-niveau med indflydelse på immuncelleinteraktion på en personlig måde.
Den neurovaskulære enhed (NVU) i det centrale nervesystem (CNS) består af de højt specialiserede mikrovaskulære endotelceller (EC’er), pericytter indlejret i endotelkældermembranen samt parenkymal kældermembran og astrocytendefødder1. Inden for NVU er hjernens mikrovaskulære endotelceller (BMEC’er) nøglekomponenterne, der danner blod-hjerne-barrieren (BBB). BMEC’er danner komplekse og kontinuerlige tætte kryds og har ekstremt lav pinocytotisk aktivitet sammenlignet med mikrovaskulære EC’er i perifere organer, hvilket gør det muligt for BBB at hæmme den frie paracellulære diffusion af vandopløselige molekyler i CNS. BMEC’ernes ekspression af specifikke tilstrømningstransportører og effluxpumper sikrer optagelse og eksport af henholdsvis næringsstoffer og skadelige molekyler fra CNS2. Derudover kontrollerer BBB strengt immuncelleindgangen til CNS ved at udtrykke lave niveauer af endoteladhæsionsmolekyler, der er afgørende for immuncellehandel i CNS3. Under fysiologiske forhold er ekspressionsniveauerne af adhæsionsmolekyler på overfladen af BMEC’er, såsom intercellulært adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1) og vaskulært celleadhæsionsmolekyle-1 (VCAM-1), lave, men disse niveauer stiger i nogle neurologiske lidelser2. Morfologisk og funktionel nedbrydning af BBB rapporteres i mange neurologiske sygdomme, såsom slagtilfælde4, multipel sklerose (MS)5 og flere neurodegenerative sygdomme 6,7,8. Detaljeret undersøgelse af BMECs cellulære og molekylære egenskaber under både fysiologiske og patologiske tilstande er en tilgang til at identificere nye terapeutiske strategier, der er målrettet BBB.
Indtil for nylig blev primære eller udødeliggjorte menneskelige og gnaver-BMEC’er brugt til at studere BBB. Det er imidlertid uklart, om konklusioner baseret på dyremodeller af BBB er let anvendelige på den humane BBB, da ekspressionen af flere vigtige molekyler, herunder vedhæftningsmolekyler og opløste bærerproteiner, adskiller sig mellem mennesker og gnavere 9,10. Selvom humane BMEC-linjer som hCMEC / D3 udtrykker passende niveauer af vedhæftningsmolekyler11, har disse udødeliggjorte BMEC’er generelt ikke komplekse tætte kryds og robuste barriereegenskaber12. Primære humane BMEC’er er nyttige til at studere barrierefunktioner13, men de er ikke let tilgængelige for alle forskere. Desuden kan primære BMEC’er fra patienter være vanskelige at opnå, da de skal indsamles gennem en hjernebiopsi eller operation, der kun udføres under specifikke kliniske forhold.
Nylige fremskridt inden for stamcelleteknologi har gjort det muligt at differentiere forskellige humane celletyper, der stammer fra stamcellekilder som humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er). De hiPSC-afledte modeller giver os mulighed for at etablere patofysiologiske modeller ved hjælp af patientafledte prøver. Flere hiPSC-afledte celletyper kan kombineres for at etablere autologe cokulturer eller organoider, der bedre efterligner fysiologiske tilstande. Flere almindeligt anvendte protokoller 14,15,16,17,18,19 kan bruges til at differentiere hiPSC-afledte BMEC-lignende celler, der har robuste diffusionsbarriereegenskaber med ekspression af BBB-specifikke transportører og effluxpumper og er nyttige til at studere den paracellulære diffusion af små molekyler, molekylære transportmekanismer og lægemiddelafgivelse til hjernen 20,21. Tidligere undersøgelser har imidlertid vist, at almindeligt anvendte hiPSC-afledte BMEC-lignende celler mangler ekspression af vigtige endoteladhæsionsmolekyler, herunder VCAM-1, selektiner og ICAM-2, som er ansvarlige for formidling af interaktioner mellem immunceller og BBB22. Desuden er tidligere hiPSC-afledte BMEC’er rapporteret at udvise blandede endotel- og epitelegenskaber på transkriptionsniveau23. Derfor udviklede vi den udvidede endotelcellekulturmetode (EECM), en ny protokol, der tillader differentiering af hiPSC’er i BMEC-lignende celler, der ligner primære humane BMEC’er med hensyn til morfologi, barriereegenskaber og endoteladhæsionsmolekyleekspression. Denne protokol beskriver de detaljerede metodologiske procedurer til differentiering af hiPSC’er til BMEC-lignende celler, der viser en moden immunfænotype.
Kritiske punkter og fejlfinding
Før EPC-differentiering påbegyndes, bør forskerne sikre, at der ikke er sket spontane celledifferentieringshændelser i hiPSC-kulturerne. Fraværet af spontant differentierede celler og brugen af rene hiPSC-kolonier er afgørende for at opnå reproducerbare resultater. HiPSC-såtætheden på dag -3 er vigtig for at opnå en høj renhed af CD31+ EPC’er efter MACS. Såtætheden for hver hiPSC-linje og hver passage kan kræve optimering. Afhængigt af hiPSC-linjen og passagenummeret kan såtætheden variere mellem 75 x 10 3 til 400 x 10 3 hiPSC’er pr. hul på en 12-brøndplade (20-100 x 103/cm2). Minimumstæthedskontrolpunktet for hiPSC’er er celletætheden på dag 2. HiPSC’erne skal nå 100% sammenløb senest på dag 2. Hvis hiPSC’erne ikke flyder sammen på dag 2, vil renheden af CD31+ EPC’er efter MACS normalt være ret lav. I dette tilfælde kan hiPSC-såtætheden øges. Hvis et stort antal differentierende celler løsner sig fra pladen omkring dag 3 til dag 5, kan den indledende hiPSC-såtæthed reduceres. 7-8 μM CHIR99021 er efter vores erfaring den optimale koncentration for de hiPSC-linjer, der anvendes her, men koncentrationen skal muligvis optimeres til andre hiPSC-linjer, der kan reagere anderledes på inhibitorbehandlingen. Renheden af CD31+ EPC’er bør bekræftes før og efter MACS. Før du fortsætter MACS, skal den forsorterede celleblanding være >10% CD31+ celler. CD31+ celleprocenter på <6% resulterer typisk i <80% EPC'er efter MACS. Optimering af den indledende såtæthed og/eller CHIR99021-koncentrationen er nødvendig i denne situation.
For vellykket selektiv passaging og generering af rene EC-monolag er renheden efter MACS af CD31+ EPC’er kritisk. Hvis renheden efter MACS er 95%. EPC-såtætheden på kollagenbelagte plader skal optimeres i henhold til hiPSC-linjen for at opnå 100% sammenløb inden for 3-7 dage. At vente, indtil EC’erne er 100% sammenflydende, vil normalt føre til vellykket selektiv passage. Men selv for 100% sammenflydende EC’er løsner nogle hiPSC-linjers SMLC’er også tidligt. I dette tilfælde kan selektiv passaging ved lavere sammenløb (f.eks. ≤80%) være effektiv. Hvis nogle SMLC’er løsner sig tidligere end EC’er, kan EC’erne ofte ikke reddes fra den blandede EC-SMLC-befolkning. I dette tilfælde kan det være nyttigt at forkorte aktiveringstiden for dissociationsreagenset ved passage af EC’er og gentagen selektiv passaging. Anvendelsen af et kommercielt dissociationsreagens snarere end trypsin som dissociationsreagens er gavnligt for selektiv passaging, da trypsin ikke tillader separat løsrivelse af EC’er og SMLC’er. Vores permeabilitetsanalyser ved hjælp af små molekylesporstoffer og test af tætte forbindelses- og vedhæftningsmolekyleekspressionsniveauer indikerer, at EPC’er, EECM-BMEC-lignende celler og SMLC’er kan opbevares i flydende nitrogen i mindst 2 år.
Metodens betydning og begrænsninger
Metoden adskiller CD31+ EPC’er fra hiPSC’er ved brug af kemiske GSK-3-hæmmere til at aktivere Wnt/β-catenin-signalering. Efter positiv udvælgelse af CD31+ EPC’er af MACS dyrkes EPC’er i et defineret endotelmedium, der fremmer differentiering i blandede endotel- og SMLC-populationer. Selektiv overførsel af disse blandede populationer med forskellige klæbeegenskaber muliggør adskillelse af EC’er fra SMLC’er. Efter en eller to passager udviser EECM-BMEC-lignende celler barriereegenskaber og ekspression af endoteladhæsionsmolekyler, der rekapitulerer dem fra primære humane BMEC’er. Co-kultur med SMLC’er eller deres supernatanter inducerer den cytokininducerede ekspression af VCAM-1.
In vivo opretholder BBB CNS-homeostase ved at etablere lav paracellulær og transcellulær permeabilitet af molekyler gennem transport af næringsstoffer via specifikke transportører og kontrol af immuncellehandel ind i CNS. For undersøgelser af BBB er en passende model, der viser de respektive molekyler og funktioner af interesse, afgørende. Produktion af EECM-BMEC-lignende celler ved hjælp af definerede reagenser og prøver fra patienter eller raske forsøgspersoner giver en skalerbar human BBB-model. Fordelene ved en model, der bruger EECM-BMEC-lignende celler i forhold til andre BBB-modeller, er: 1) en morfologi og endoteltranskriptomprofil30, der ligner den for primære humane BMEC’er; 2) tilstedeværelsen af modne tætte kryds; 3) ønskelige barriereegenskaber og 4) den robuste ekspression af endoteladhæsionsmolekyler, herunder ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, E- og P-selectin, CD99, melanomcelleadhæsionsmolekyle (MCAM) og aktiveret leukocytcelleadhæsionsmolekyle (ALCAM)22. Således er denne model særlig nyttig til at studere interaktioner mellem immunceller og BMEC’er. Selvom permeabiliteten af små molekylesporstoffer er højere for EECM-BMEC-lignende celler end den, der tidligere er rapporteret for iPSC-afledte BMEC-lignende celler14,15, sammenligner barriereegenskaberne ganske godt med dem, der er beskrevet for primære humane BMEC’er. Denne lighed indikerer, at EECM-BMEC-lignende celler sandsynligvis er en god in vitro-model af BBB. E-selectinekspression på EECM-BMEC-lignende celler under fysiologiske forhold skal tages i betragtning, når denne model anvendes til at studere ikke-betændte BBB’er, der mangler konstitutiv E-selectinekspression in vivo31. I vores tidligere undersøgelse viste vi, at EECM-BMEC-lignende celler kunne fænokopiere BBB, som observeret i hjernen hos MS-patienter med hensyn til forstyrrede tætte kryds. Dette resulterer i en højere permeabilitet af små molekyler og øget ekspression af funktionelt adhæsionsmolekyle, hvilket medierer den øgede vedhæftning og transmigration af immunceller på tværs af de BMEC-lignende celler32. Desuden viste vi, at aktivering af Wnt/β-catenin-signalering kan forbedre forstyrrelsen af snævre kryds og øget VCAM-1-ekspression i MS-afledte EECM-BMEC-lignende celler32. Disse resultater indikerer, at modellen faktisk er nyttig til at studere BBB’s rolle i neuroimmunologiske sygdomme, såsom MS.
Samlet set er EECM-BMEC-lignende celler et lovende værktøj til dybdegående forståelse af patofysiologiske mekanismer på BBB-niveau og som et værktøj til at udvikle nye terapeutiske mål for BBB-stabilisering. I fremtiden kan modellen anvendes til at studere BBB-dysfunktion i et bredere spektrum af sygdomme og kan åbne muligheder for nye terapeutiske tilgange.
The authors have nothing to disclose.
HN blev støttet af Uehara Memorial Foundation, et ECTRIMS Postdoctoral Research Exchange Fellowship, JSPS under Joint Research Program implementeret i samarbejde med SNSF (JRPs) Grant No. JPJSJRP20221507 og KAKENHI Grant No. 22K15711, JST FOREST Program (Grant Number JPMJFR2269, Japan), YOKOYAMA Foundation for Clinical Pharmacology Grant No. YRY-2217, ICHIRO KANEHARA FOUNDATION, Narishige Neuroscience Research Foundation, NOVARTIS Foundation (Japan) til fremme af videnskab og YAMAGUCHI UNIVERSITY FUND. BE blev støttet af Swiss MS Society og Swiss National Science Foundation (tilskud 310030_189080 og ZLJZ3_214086) og Strategic Japanese-Swiss Science and Technology Programme (SJSSTP) tilskud IZLJZ3_214086.
0.22 mm Syringe filter | TPP | 99722 | |
15 mL Centrifuge tube | Falcon | 352196 | |
40 μm Falcon cell strainer | Falcon | 352340 | |
5 mL Round-bottom tube | SPL | 40005 | |
50 mL Centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
96-Well plate, round bottom | SPL | 34096 | |
Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-500ml | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634 | |
All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
B-27 Supplement (503), serum free | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
Bovine serum albumin (BSA), 7.5% in dPBS | Sigma-Aldrich | A8412 | |
CellAdhere Dilution Buffer | STEMCELL Technologies | ST-07183 | |
CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
Chamber slides | Thermo Fischer Scientific | 178599 | |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | |
Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Corning tissue culture plates (12-well) | Corning | 3512 | |
Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
Cryo tube innercap 2.0 mL | Watson | 1396-201S | |
Dimethylsulfoxide (DMSO), sterile | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM (13), [+] 4.5 g/L D-glucose, [-] L-glutamine, [-] pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 31053-028 | |
Dulbecco’s (d) PBS (without calcium, magnesium) | Thermo Fisher | 14190250 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/nutrient mixture F-12 (DMEM-F12) | Thermo Fischer Scientific | 11320074 | |
EasySepFITC Positive Selection Kit II | STEMCELL Technologies | 18558 | |
EasySepMagnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid Solution0.02% in DPBS | Sigma | E8008-100ML | |
Fetal Bovine Serum, qualified | Thermo Fischer Scientific | 10270106 | |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Ficoll-Paque PLUS | Sigma-Aldrich | GE17144002 | |
FIJI software (Version 2.0.0) | Image J, USA | ||
FlowJo version10 | BD | ||
Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fischer Scientific | 35050-061 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
HCL | Sigma-Aldrich | H1758 | |
HEPES buffer solution | Thermo Fischer Scientific | 15630-056 | |
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) | Thermo Fischer Scientific | 11111-044 | |
Human fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Tocris | 233-FB-500 | |
iPS human induced pluripotent stem cells | Riken RBC | HPS1006 | |
Kanamycin Sulfate (100x) | Thermo Fischer Scientific | 15160-047 | |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
L-Glutamine 200 mM (1003) | Thermo Fischer Scientific | 25030-024 | |
Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | |
MEM NEAA (1003) | Thermo Fischer Scientific | 11140-035 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | |
mTeSR Plus-cGMP | STEMCELL Technologies | ST-100-0276 | |
mTeSR1 complete kit (basal medium plus 53 supplement) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
Paraformaldehyde | Millipore | 104005 | |
Pen Strep | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | |
Recombinant Human IFN-gamma Protein | R&D Systems | 285-IF-100 | |
Recombinant Human IL-2 | BD Biosciences | 554603 | |
Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
RPMI medium 1640 | Thermo Fischer Scientific | 21875-034 | |
Scalpel | FEATHER | 2975-11 | |
Skim milk | BD Biosciences | 232100 | |
Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | 71290 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 11360-039 | |
Transwells, PC Membrane, 0.4 mm, 12 mm, TC-Treated | Corning | 3401 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | 93362 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Vitronectin XF | STEMCELL Technologies | 078180 | |
Water, sterile, cell culture | Sigma-Aldrich | W3500 |