Het huidige artikel heeft tot doel gedetailleerde en adequate protocollen te bieden voor de isolatie van plant-geassocieerde endofytische schimmels, langdurige bewaring van isolaten, morfologische karakterisering en totale DNA-extractie voor daaropvolgende moleculaire identificatie en metagenomische analyses.
Mycoheterotrofe planten vertonen een van de meest extreme vormen van mycorrhiza-afhankelijkheid, omdat ze hun autotrofe capaciteit volledig hebben verloren. Net zo essentieel als elke andere vitale hulpbron, zijn de schimmels waarmee deze planten nauw associëren essentieel voor hen. Daarom zijn enkele van de meest relevante technieken bij het bestuderen van mycoheterotrofe soorten degene die het onderzoek van geassocieerde schimmels mogelijk maken, met name die welke wortels en ondergrondse organen bewonen. In deze context worden vaak technieken toegepast voor het identificeren van cultuurafhankelijke en cultuuronafhankelijke endofytische schimmels. Het isoleren van schimmelendofyten biedt een middel om ze morfologisch te identificeren, hun diversiteit te analyseren en inocula te behouden voor toepassingen in de symbiotische ontkieming van orchideeënzaden. Het is echter bekend dat er een grote verscheidenheid aan niet-kweekbare schimmels is die plantenweefsels bewonen. Cultuuronafhankelijke moleculaire identificatietechnieken bieden dus een bredere dekking van soortendiversiteit en -overvloed. Dit artikel beoogt de methodologische ondersteuning te bieden die nodig is voor het opstarten van twee onderzoeksprocedures: een cultuurafhankelijke en een onafhankelijke. Met betrekking tot het cultuurafhankelijke protocol worden de processen voor het verzamelen en bewaren van plantenmonsters van verzamelplaatsen naar laboratoriumfaciliteiten gedetailleerd, samen met het isoleren van draadvormige schimmels uit ondergrondse en luchtorganen van mycoheterotrofe planten, het bijhouden van een verzameling isolaten, het morfologisch karakteriseren van hyfen door middel van een objectglaasjescultuurmethodologie en moleculaire identificatie van schimmels door totale DNA-extractie. De gedetailleerde procedures omvatten cultuuronafhankelijke methodologieën en omvatten het verzamelen van plantenmonsters voor metagenomische analyses en totale DNA-extractie uit achlorofylachtige plantenorganen met behulp van een commerciële kit. Ten slotte worden ook continuïteitsprotocollen (bijv. polymerasekettingreactie [PCR], sequencing) voorgesteld voor analyses, en technieken worden hier gepresenteerd.
Endofytische schimmels zijn per definitie schimmels die het inwendige van plantenorganen en -weefsels bewonen bij onopvallende infecties (d.w.z. zonder schade toe te brengen aan hun gastheer)1,2. Deze schimmels kunnen neutraal of gunstig interageren met waardplanten, kunnen resistentie verlenen tegen ziekteverwekkers en ongunstige omgevingsomstandigheden, en kunnen bijdragen aan de synthese van nuttige verbindingen voor de plant (bijv. groeifactoren en andere fytohormonen)1,3. Mycorrhiza-endofyten zijn schimmels die mycorrhiza-associaties met de plant tot stand brengen en deelnemen aan de overdracht van voedingsstoffen4. In Orchidaceae is de interactie met mycorrhiza-endofyten van fundamenteel belang voor het ontkiemen van zaden in de overgrote meerderheid van de soorten, en voor de vestiging van zaailingen in alle planten in defamilie5. In dergelijke contexten vertegenwoordigen mycoheterotrofe orchideeën een geval van totale afhankelijkheid van hun mycorrhiza-partners, aangezien ze gedurende hun hele levenscyclus afhankelijk zijn van de overdracht van minerale voedingsstoffen en koolstofverbindingen door deze schimmels6. Daarom is de isolatie en identificatie van associërende schimmels een fundamentele basis bij het onderzoeken van mycoheterotrofe levensstrategieën. Bovendien is er weinig bekend over de rol van schimmelendofyten in mycoheterotrofe planten of zelfs de werkelijke diversiteit van deze schimmels 7,8.
Het onderzoek naar endofytische schimmels kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende technieken, die traditioneel als cultuuronafhankelijk of -afhankelijk worden omschreven, bijvoorbeeld: (a) directe observatie, (b) schimmelisolatie en morfologische en/of moleculaire identificatie, en (c) totale DNA-extractie van plantenweefsels en moleculaire identificatie9. In directe observatie (a) kunnen endofytische schimmels worden onderzocht terwijl ze zich nog in het inwendige van plantencellen en weefsels bevinden door middel van licht- of elektronenmicroscopie9, aangezien verschillende microscopieprotocollen worden beschreven door Pena-Passos et al.10. Door isolatiemethoden (b) kunnen endofyten van schimmels worden gekarakteriseerd op basis van hun kolonies, hyfen en morfologie van de voortplantings- of resistentiestructuur. Ook is het via isolatietechnieken mogelijk om de moleculaire identificatie van isolaten uit te voeren door middel van DNA-extractie, amplificatie van moleculaire identificatiesequenties (barcodes of vingerafdrukken) en sequencing11. Deze laatste techniek (c) maakt de moleculaire identificatie van endofytische schimmels mogelijk door middel van DNA-extractie in het inwendige van plantenweefsels (metabarcoding), gevolgd door bibliotheekvoorbereiding en sequencing12.
Bovendien kunnen schimmelisolaten worden toegepast in symbiotische kiemproeven, met behulp van zaden van autotrofe of mycoheterotrofe orchideeën. Een voorbeeld van een dergelijke toepassing is het onderzoek van Sisti et al.13, waarin de kieming en de beginstadia van de ontwikkeling van protocormen worden beschreven in Pogoniopsis schenckii, een mycoheterotrofe orchidee, in combinatie met enkele van zijn isolaten, bestaande uit niet-mycorrhiza-endofytische schimmels. Het toegepaste symbiotische kiemprotocol wordt gedetailleerd beschreven en gepresenteerd in een video van Pena-Passos et al.10. Het isoleren van schimmels in associatie met verschillende plantenorganen maakt divers onderzoek mogelijk met betrekking tot de aard van plant-schimmelinteracties (bijv. om ecologische of fysiologische aspecten van de associatie te begrijpen, evenals onderzoek naar de overdracht van voedingsstoffen van schimmels naar de plant)9.
De methodologieën die in sectie 1 worden gepresenteerd, zijn gebaseerd op een verzameling van ondergrondse orgaanmonsters, aangezien deze organen de meeste moeilijkheden opleveren bij het verzamelen, en ze zijn van groot belang omdat mycorrhiza-endofyten ze koloniseren. Beide opgenomen protocollen (stappen 1.1 en 1.2) kunnen echter worden toegepast op andere mycoheterotrofe plantenorganen (bijv. wortelstokken, bloemstengels en vruchten). De in stap 1.1 beschreven verzamelmethode is bedoeld voor het isoleren van endofytische schimmels (sectie 2), voor morfologische karakterisering (secties 4 en 5) en/of totale DNA-extractie voor isolaatidentificatie (sectie 6). Aan de andere kant wordt de in stap 1.2 beschreven verzamelmethode uitsluitend gebruikt voor de totale DNA-extractie van plantenweefsels voor metabarcodingtechnieken (punt 7). In hoofdstuk 3 worden vier methoden voor de opslag en conservering van draadvormige schimmels gepresenteerd, twee voor opslag op korte termijn (3-6 maanden) en de andere twee geschikt voor opslag op lange termijn (>1 jaar). De morfologische karakterisering (secties 4 en 5) kan in verband worden gebracht met moleculaire identificatie om deze te versterken en belangrijke informatie te verschaffen over de macro- en micromorfologie van schimmels. Figuur 1 geeft een overzicht van de collectieve methodologieën die daarna worden beschreven.
Figuur 1: Schematische samenvatting van de gepresenteerde methoden. Plantenverzameling en schimmelisolatie, conservering en moleculaire identificatie door middel van cultuurafhankelijke en -onafhankelijke methodologieën. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De oppervlakkige ontsmetting van plantenmonsters is een van de meest kritieke fasen in het gepresenteerde protocol. Geen contaminatie in de PDA-vaat met druppels van de laatste wasbeurt is zeer gewenst. Bacteriën worden vaak waargenomen als verontreinigingen in de isolatieschalen, meestal meer dan sporulerende schimmels in de lucht, aangezien endofytische bacteriën ook veel voorkomen in plantenweefsels 3,11. De toevoeging van antibiotica in het kweekmedium bij …
The authors have nothing to disclose.
We danken de financiering van FAPESP (2015/26479-6) en CNPq (447453/2014-9). JLSM bedankt CNPq voor productiviteitssubsidies (303664/2020-7). MPP bedankt Capes (master’s degree scholarship, proces 88887.600591/2021-00) en CNPq.
Adhesive tape | (from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses) | ||
Ampicillin | Sigma-Aldrich | A5354 | (for installation of plant fragments; other antibiotics may be used – check step 2.2.1) |
Autoclave | (from any company, for materials sterilization in many steps) | ||
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A1296 | (for many steps) |
C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions | Qiagen | 12888-50 | (purchased with DNeasy PowerSoil kit) |
Centrifuge | Merck/Eppendorf | 5810 G | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Centrifuge tubes | Merck | CLS430828 | (for samples collection) |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Congo red | Supelco | 75768 | (for hyphae staining) |
Cryotubes | Merck | BR114831 | (for many steps) |
Ethanol | Supelco | 100983 | It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps) |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Filter paper | Merck | WHA10010155 | (for many steps) |
Glass test tubes | Merck | CLS7082516 | (for cryopreservation in unhulled rice grains) |
Glass wool | Supelco | 20411 | (for cryopreservation in unhulled rice grains) |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite) |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB) |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Lactic acid | Sigma-Aldrich | 252476 | (for preparing LPCB – hyphae staining) |
Lactophenol blue solution (LPCB) | Sigma-Aldrich | 61335 | (for hyphae staining) |
Laminar flow hood | (class I, from any company, for many steps) | ||
Light microscope | (from any company, for hyphae observation) | ||
MB Spin Columns | Qiagen | 12888-50 | (purchased with DNeasy PowerSoil kit) |
Methyl blue (cotton blue) | Sigma-Aldrich | M5528 | (for preparing LPCB – hyphae staining) |
Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Merck | HS4323 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Microcentrifuge tube (2 mL) | Merck | BR780546 | (for many steps) |
Mineral oil | (for preservation of fungal isolates) | ||
Paper bags | Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection) | ||
Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm) | Merck/Pyrex | SLW1480/10D | (autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones) |
Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm) | Merck/Aldrich | Z740618 | (for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable) |
Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm) | Merck/Brand | BR455732 | (for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable) |
Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | (for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB) |
Porcelain mortar | Sigma-Aldrich | Z247464 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Porcelain pestle | Sigma-Aldrich | Z247502 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Potato dextrose agar (PDA) | Millipore | P2182 | (for many steps) |
PowerBead tubes | Qiagen | 12888-50 | (purchased with DNeasy PowerSoil kit) |
Rapid mounting medium (Entellan) | Sigma-Aldrich | 1.0796 | (for fungi slide culture) |
Silica gel | Supelco | 717185 | (for cryopreservation in unhulled rice grains) |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine) | (commercial product, for superficial desinfestation) | ||
Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit) | Qiagen | 12888-50 | (for total DNA extraction from plant organs) |
Spectrophotometer – Nanodrop 2000/2000c | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | (for total DNA extraction from plant organs) |
Stereomicroscope | (=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses) | ||
Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | (for installation of plant fragments) |
Thermoblock | Merck/Eppendorf | EP5362000035 | (or from other companies) |
Tissue homogenizer and cell lyzer | SPEX SamplePrep | 2010 Geno/Grinder – Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs) | |
Toluidine blue O | Sigma-Aldrich/Harleco | 364-M | (for hyphae staining) |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9531 | (for cryopreservation in vermiculite) |
Tris Base Solution (Tris) | Sigma-Aldrich | T1699 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Unhulled rice grains | (for cryopreservation) | ||
U-shaped glass rod | (or an adaptation – check step 5.4.1, for fungi slide culture) | ||
Vermiculite | Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite) | ||
Vortexer | Sigma-Aldrich/BenchMixer | BMSBV1000 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | (for cryopreservation in vermiculite) |