Isolering, karakterisering og total DNA-ekstraksjon for å identifisere endofytiske sopp i mykoheterotrofe planter

Summary

Den nåværende artikkelen tar sikte på å gi detaljerte og tilstrekkelige protokoller for isolering av planteassosierte endofytiske sopp, langsiktig bevaring av isolater, morfologisk karakterisering og total DNA-ekstraksjon for påfølgende molekylær identifikasjon og metagenomiske analyser.

Abstract

Mycoheterotrophic planter presenterer en av de mest ekstreme former for mycorrhizal avhengighet, og har helt mistet sin autotrofe kapasitet. Like viktig som enhver annen viktig ressurs, er soppene som disse plantene intimt forbinder med avgjørende for dem. Derfor er noen av de mest relevante teknikkene for å studere mykoheterotrofe arter de som muliggjør undersøkelse av tilknyttede sopp, spesielt de som bor i røtter og underjordiske organer. I denne sammenheng brukes ofte teknikker for å identifisere kulturavhengige og kulturuavhengige endofytiske sopp. Isolering av soppendofytter gir et middel for morfologisk å identifisere dem, analysere deres mangfold og opprettholde inokula for applikasjoner i symbiotisk spiring av orkidéfrø. Det er imidlertid kjent at det er et stort utvalg av ikke-kulturable sopp som bor i plantevev. Dermed tilbyr kulturuavhengige molekylære identifikasjonsteknikker et bredere dekke av artsmangfold og overflod. Denne artikkelen tar sikte på å gi den metodiske støtten som er nødvendig for å starte to undersøkelsesprosedyrer: en kulturavhengig og en uavhengig. Når det gjelder den kulturavhengige protokollen, er prosessene for innsamling og vedlikehold av planteprøver fra innsamlingssteder til laboratorieanlegg detaljert, sammen med isolering av trådformede sopp fra underjordiske og luftorganer av mykoheterotrofe planter, holde en samling av isolater, morfologisk karakterisere hyfer ved lysbildekulturmetodikk og molekylær identifikasjon av sopp ved total DNA-ekstraksjon. De detaljerte prosedyrene omfatter kulturuavhengige metoder og inkluderer innsamling av planteprøver for metagenomiske analyser og total DNA-ekstraksjon fra aklorofyllløse planteorganer ved hjelp av et kommersielt sett. Til slutt foreslås også kontinuitetsprotokoller (f.eks. polymerasekjedereaksjon [PCR], sekvensering) for analyser, og teknikker presenteres her.

Introduction

Endofytiske sopp er per definisjon de som bor i det indre av planteorganer og vev i iøynefallende infeksjoner (dvs. uten å skade verten)^1,2. Disse soppene kan nøytralt eller fordelaktig samhandle med vertsplanter, kan gi motstand mot patogener og ugunstige miljøforhold, og kan bidra til syntese av gunstige forbindelser for planten (f.eks. vekstfaktorer og andre fytohormoner)^1,3. Mycorrhizal endofytter er sopp som etablerer mycorrhizal foreninger med planten, og deltar i næringsoverføring⁴. Hos Orchidaceae er samspillet med mycorrhizal endofytter grunnleggende for frøspredning hos de aller fleste arter, og frøplanteetablering i alle plantene i familien⁵. I slike sammenhenger representerer mykoheterotrofe orkideer et tilfelle av total avhengighet av deres mykorrhizalpartnere, da de er avhengige av mineralnæringsstoffer og overføring av karbonforbindelser av disse soppene i hele livssyklusen⁶. Derfor er isolering og identifisering av assosierende sopp en grunnleggende base når man undersøker mykoheterotrofe livsstrategier. Videre er lite kjent om rollene til soppendofytter i mykoheterotrofe planter eller til og med det virkelige mangfoldet av disse soppene ^7,8.

Undersøkelsen av endofytiske sopp kan utføres via forskjellige teknikker, tradisjonelt beskrevet som kulturuavhengige eller -avhengige, for eksempel: (a) direkte observasjon, (b) soppisolering og morfologisk og/eller molekylær identifikasjon, og (c) total DNA-ekstraksjon av plantevev og molekylær identifikasjon⁹. Ved direkte observasjon (a) kan endofytiske sopp undersøkes mens de fortsatt er i det indre av planteceller og vev ved lys eller elektronmikroskopi⁹, da forskjellige mikroskopiprotokoller er beskrevet av Pena-Passos et ^al.10. Ved isolasjonsmetoder (b) kan soppendofytter karakteriseres i henhold til deres kolonier, hyfer og reproduktiv eller resistensstrukturmorfologi. Også via isolasjonsteknikker er det mulig å utføre molekylær identifikasjon av isolater gjennom DNA-ekstraksjon, amplifisering av molekylære identifikasjonssekvenser (strekkoder eller fingeravtrykk) og sekvensering¹¹. Sistnevnte teknikk (c) muliggjør molekylær identifikasjon av endofytiske sopp per DNA-ekstraksjon mens den er i det indre av plantevev (metabarkoding), etterfulgt av bibliotekforberedelse og sekvensering¹².

Videre kan soppisolater brukes i symbiotiske spiringsforsøk, ved bruk av frø fra autotrofe eller mykoheterotrofe orkideer. Et eksempel på en slik applikasjon er undersøkelsen utført av Sisti et ^al.13, som beskriver spiring og innledende stadier av protokormutvikling i Pogoniopsis schenckii, en mykoheterotrofisk orkidé, i forbindelse med noen av dens isolater, som omfatter ikke-mykorrhizal endofytiske sopp. Den anvendte symbiotiske spiringsprotokollen er detaljert og presentert i en video av Pena-Passos et ^al.10. Isolering av sopp i forbindelse med forskjellige planteorganer tillater ulike undersøkelsesfokus angående arten av plante-sopp-interaksjoner (f.eks. å forstå enten økologiske eller fysiologiske aspekter av foreningen, samt undersøkelser av næringsoverføringen fra sopp til planten)⁹.

Metodene som presenteres i avsnitt 1 er basert på en samling av underjordiske organprøver, da disse organene presenterer de fleste vanskeligheter med innsamling, og de er av stor interesse siden mykorrhizale endofytter koloniserer dem. Imidlertid kan begge de inkluderte protokollene (trinn 1.1 og 1.2) brukes på andre mykoheterotrofe planteorganer (f.eks. jordstengler, blomsterstengler og frukt). Innsamlingsmetodikken beskrevet i trinn 1.1 er beregnet for isolering av endofytisk sopp (pkt. 2) for morfologisk karakterisering (pkt. 4 og 5) og/eller total DNA-ekstraksjon for isolatidentifikasjon (pkt. 6). På den annen side er innsamlingsmetodikken beskrevet i trinn 1.2 utelukkende tilordnet total DNA-ekstraksjon av plantevev for metastrekkodingsteknikker (avsnitt 7). I avsnitt 3 presenteres fire metoder for lagring og konservering av trådformet sopp, to for korttidslagring (3-6 måneder) og de to andre tilstrekkelig for langtidslagring (>1 år). Den morfologiske karakteriseringen (avsnitt 4 og 5) kan være assosiert med molekylær identifikasjon for å forsterke den og gi viktig informasjon om soppmakro- og mikromorfologi. Figur 1 oppsummerer de kollektive metodene som er beskrevet deretter.

Figur 1: Skjematisk oppsummering av de presenterte metodene. Planteinnsamling og soppisolering, bevaring og molekylær identifikasjon ved kulturavhengige og -uavhengige metoder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Innsamling av planteprøver Prøvetaking for dyrkningsavhengige metoderForsiktig grave de underjordiske organene; Disse kan være røtter, stengler, jordstengler eller lagringsorganer av planten som skal samles inn. Bortsett fra svært kompakte jordarter, samle disse prøvene for hånd.MERK: Bruk av verktøy som sparkel eller skjeer i dette trinnet er dårlig anbefalt, da det kan skade de skjøre strukturer av mykoheterotrofe planter og kan forårsake vevsforurensning av ikke-end…

Representative Results

I isolasjonsprotokollen, med tanke på at det er forurensning fra vannet som ble brukt ved siste vask og forurensningen også påvises i petriskålene med inokulerte fragmenter, kan forskjellige tiltak iverksettes, avhengig av type forurensning (tabell 1). Denne prosedyren må gjentas fra begynnelsen i tilfelle svært sporulerende soppforurensninger, som også presenterer akselerert vekst og intenst multipliserende bakterier, resistente mot de valgte antibiotika. I stedet…

Discussion

Den overfladiske desinfiseringen av planteprøver er et av de mest kritiske stadiene i den presenterte protokollen. Ingen forurensning i PDA-oppvasken med dråper fra siste vask er svært ønskelig. Bakterier observeres ofte som forurensninger i isolasjonsskålene, vanligvis mer enn luftbårne sporulerende sopp, med tanke på at endofytiske bakterier også er vanlige i plantevev ^3,11. Dermed er tilsetning av antibiotika i kulturmediet ved installasjon av organfra…

Materials

Adhesive tape			(from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses)
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A5354	(for installation of plant fragments; other antibiotics may be used – check step 2.2.1)
Autoclave			(from any company, for materials sterilization in many steps)
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A1296	(for many steps)
C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Centrifuge	Merck/Eppendorf	5810 G	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Centrifuge tubes	Merck	CLS430828	(for samples collection)
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Congo red	Supelco	75768	(for hyphae staining)
Cryotubes	Merck	BR114831	(for many steps)
Ethanol	Supelco	100983	It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Filter paper	Merck	WHA10010155	(for many steps)
Glass test tubes	Merck	CLS7082516	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glass wool	Supelco	20411	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB)
Isopropanol	Sigma-Aldrich	563935	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Lactic acid	Sigma-Aldrich	252476	(for preparing LPCB – hyphae staining)
Lactophenol blue solution (LPCB)	Sigma-Aldrich	61335	(for hyphae staining)
Laminar flow hood			(class I, from any company, for many steps)
Light microscope			(from any company, for hyphae observation)
MB Spin Columns	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Methyl blue (cotton blue)	Sigma-Aldrich	M5528	(for preparing LPCB – hyphae staining)
Microcentrifuge tube (1.5 mL)	Merck	HS4323	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Microcentrifuge tube (2 mL)	Merck	BR780546	(for many steps)
Mineral oil			(for preservation of fungal isolates)
Paper bags			Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection)
Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm)	Merck/Pyrex	SLW1480/10D	(autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones)
Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm)	Merck/Aldrich	Z740618	(for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm)	Merck/Brand	BR455732	(for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Phenol	Sigma-Aldrich	P1037	(for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB)
Porcelain mortar	Sigma-Aldrich	Z247464	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Porcelain pestle	Sigma-Aldrich	Z247502	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Potato dextrose agar (PDA)	Millipore	P2182	(for many steps)
PowerBead tubes	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Rapid mounting medium (Entellan)	Sigma-Aldrich	1.0796	(for fungi slide culture)
Silica gel	Supelco	717185	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine)			(commercial product, for superficial desinfestation)
Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit)	Qiagen	12888-50	(for total DNA extraction from plant organs)
Spectrophotometer – Nanodrop 2000/2000c	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP	(for total DNA extraction from plant organs)
Stereomicroscope			(=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses)
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660	(for installation of plant fragments)
Thermoblock	Merck/Eppendorf	EP5362000035	(or from other companies)
Tissue homogenizer and cell lyzer	SPEX SamplePrep		2010 Geno/Grinder – Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs)
Toluidine blue O	Sigma-Aldrich/Harleco	364-M	(for hyphae staining)
Trehalose	Sigma-Aldrich	T9531	(for cryopreservation in vermiculite)
Tris Base Solution (Tris)	Sigma-Aldrich	T1699	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Unhulled rice grains			(for cryopreservation)
U-shaped glass rod			(or an adaptation – check step 5.4.1, for fungi slide culture)
Vermiculite			Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite)
Vortexer	Sigma-Aldrich/BenchMixer	BMSBV1000	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625	(for cryopreservation in vermiculite)