Amélioration du dénombrement des spores de Bacillus subtilis et de l’analyse des marquages en cytométrie en flux

Summary

Ce protocole se concentre sur l’utilisation de la cytométrie en flux et des billes de comptage pour quantifier les spores bactériennes marquées au bromure d’éthidium. La méthode est également efficace pour analyser le couplage covalent des protéines à la surface des spores intactes.

Abstract

Les spores de Bacillus subtilis ont déjà été proposées pour différentes applications biotechnologiques et immunologiques ; Cependant, il est de plus en plus nécessaire de développer des méthodologies qui améliorent la détection des antigènes immobilisés à la surface des spores ainsi que leur quantification. Les analyses basées sur la cytométrie en flux ont déjà été proposées comme des approches rapides, fiables et spécifiques pour détecter les cellules marquées de B. subtilis. Ici, nous proposons l’utilisation de la cytométrie en flux pour évaluer l’efficacité d’affichage d’un anticorps fluorescent (FA) à la surface de la spore et quantifier le nombre de spores à l’aide de billes de comptage.

Pour cela, nous avons utilisé le bromure d’éthidium comme marqueur d’ADN et un anticorps marqué à l’allophycocyanine (APC), qui a été couplé aux spores, comme marqueur de surface. La quantification des spores a été réalisée à l’aide de billes de comptage car cette technique démontre une grande précision dans la détection des cellules. Les spores marquées ont été analysées à l’aide d’un cytomètre en flux, ce qui a confirmé le couplage. En conséquence, il a été démontré que le marquage de l’ADN améliorait la précision de la quantification par cytométrie en flux, pour la détection des spores germées. On a observé que le bromure d’éthidium n’était pas en mesure de marquer les spores dormantes ; Cependant, cette technique permet de déterminer plus précisément le nombre de spores avec des protéines fluorescentes couplées à leur surface, contribuant ainsi au développement d’études axées sur l’utilisation des spores comme plate-forme biotechnologique dans différentes applications.

Introduction

Bacillus subtilis est une bactérie gram-positive en forme de bâtonnet qui est capable de produire des spores au repos lorsque les conditions environnementales ne permettent pas la croissance cellulaire¹. Les spores sont des formes cellulaires extrêmement stables et celles de plusieurs espèces, dont B. subtilis, sont largement utilisées comme probiotiques à usage humain et animal². En raison de ses propriétés de résistance et d’innocuité, la spore de B. subtilis, qui présente des protéines hétérologues, a été proposée comme adjuvant muqueux, système d’administration de vaccins et plate-forme d’immobilisation enzymatique ^3,4.

Pour obtenir des spores de B. subtilis, il est nécessaire de l’exposer à une privation de nutriments à l’aide d’un milieu de culture spécial. Après avoir obtenu et purifié ces spores, il faut les quantifier pour améliorer l’efficacité du test ^5,6. Ainsi, certaines méthodes sont appliquées pour analyser la concentration des spores obtenues. Il est possible d’utiliser le comptage des plaques et une chambre Petroff-Hausser, également connue sous le nom de chambre de comptage. Ce dernier a été développé à l’origine pour déterminer la concentration des cellules sanguines ; Cependant, il est possible de l’utiliser dans le domaine de la microbiologie pour le comptage des spores ^7,8. Bien qu’il s’agisse de la méthode standard utilisée pour le comptage cellulaire, la lecture est laborieuse car cette méthode est entièrement manuelle et sa précision dépend de l’expérience de l’opérateur.

Les analyses basées sur la cytométrie en flux (FC) ont déjà été proposées comme des approches rapides, fiables et spécifiques pour détecter les cellules marquées de Bacillus spp. L’utilisation de billes de comptage de cytométrie en flux a permis de garantir la reproductibilité dans le comptage cellulaire, dans les examens de routine (numération absolue des lymphocytes T CD4 et CD8) et dans le développement de la recherche portant sur des particules susceptibles d’être détectées et comptées par cytométrie en flux⁹. Godjafrey et Alsharif ont suggéré l’utilisation de billes de comptage pour la quantification de la FC des spores non marquées¹⁰. L’utilisation de la cytométrie en flux a été décrite pour le suivi de la sporulation chez Bacillus spp. par marquage de l’ADN des spores 10,11,12,13. Une autre étude a utilisé FC pour évaluer la quantité de protéines marquées par fluorescence à la surface des spores¹⁵.

Cette étude visait à utiliser des billes de comptage commerciales pour assurer une norme de reproductibilité en ce qui concerne le comptage d’événements à l’aide de la cytométrie en flux. Dans cet article, nous suggérons l’utilisation de billes de comptage pour le comptage cellulaire dans la FC afin d’affiner le dénombrement des spores et d’évaluer l’efficacité du couplage des anticorps marqués par fluorescence à la surface des spores.

Protocol

Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et logiciels utilisés dans ce protocole. 1. Réglage de la cytométrie en flux Alignement des paramètres optiques d’un cytomètre en flux couplé à un ordinateurConnectez-vous au logiciel Cytometer. Dans l’espace de travail du logiciel, sélectionnez Cytomètre | Démarrez et attendez quelques minutes |…

Representative Results

Dans les échantillons de spores autoclavées (SA), 2 × 103 spores/μl et 1 × 103 spores/μl ont été détectées à l’aide de billes de comptage et de la méthode de Petroff-Hausser, respectivement (figure 2). Figure 1 : Schéma général de quantification des spores. (A</s…

Discussion

Les méthodes traditionnelles, telles que le comptage sur plaque des colonies, prennent non seulement du temps, mais nécessitent également des cellules viables et ne permettent pas de quantifier les spores inactivées⁵. La chambre Petroff-Hausser est une méthodologie alternative, mais elle nécessite un microscopiste expérimenté pour la réaliser. La cytométrie en flux s’est avérée être une alternative utile à cette fin.

Genovese et ^al.12</…

Materials

((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC)	Sigma	341006
(N-hydroxysuccinimide) (NHS)	Sigma	130672
Anti-human fluorescent antibody	BioLegend	501410	APC anti-human IL-10
Anti-mouse fluorescent antibody	Thermo Scientific	A32723	Alexa Fluor Plus 488
BD FACSCanto II	BD		Flow cytometer
BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x)	BD	642412	Quality control reagent
BD FACSDiva Software v. 6.1.3	BD	643629	Software
Centrifuge MegaFuge 8R	Thermo Scientific	75007213
Counting Beads	BD	340334	TruCount Tubes
Eclipse 80i	Nikon		Fluorescent Microsope
Ethidium Bromide	Ludwig Biotec
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	A4503
Plastic Microtubes	Eppendorf
Polystyrene tube	Falcon	352008	5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile