Automatização do processamento de brotos cítricos para detecção de patógenos a jusante por meio de engenharia de instrumentos

Summary

Nós projetamos, fabricamos e validamos um instrumento que processa rapidamente tecidos de brotos cítricos ricos em floema. Em comparação com os métodos atuais, o extrator de tecido de budwood (BTE) aumentou o rendimento da amostra e diminuiu os custos de mão de obra e equipamentos necessários.

Abstract

Patógenos de citros transmissíveis por enxerto e limitados por floema, como vírus, viróides e bactérias, são responsáveis por epidemias devastadoras e graves perdas econômicas em todo o mundo. Por exemplo, o vírus da tristeza dos citros matou mais de 100 milhões de árvores cítricas em todo o mundo, enquanto o “Candidatus Liberibacter asiaticus” custou à Flórida US$ 9 bilhões. O uso de brotos de citros testados por patógenos para propagação de árvores é fundamental para o manejo desses patógenos. O Programa de Proteção Clonal de Citros (CCPP) da Universidade da Califórnia, Riverside, usa ensaios de reação em cadeia da polimerase (PCR) para testar milhares de amostras de árvores fontes de brotos cítricos todos os anos para proteger os citros da Califórnia e fornecer unidades de propagação limpas para a National Clean Plant Network. Um gargalo severo na detecção molecular de alto rendimento de vírus e viróides cítricos é a etapa de processamento de tecidos vegetais.

A preparação adequada dos tecidos é crítica para a extração de ácidos nucleicos de qualidade e uso a jusante em ensaios de PCR. O corte, pesagem, liofilização, moagem e centrifugação de tecidos vegetais a baixas temperaturas para evitar a degradação do ácido nucleico consome muito tempo e trabalho e requer equipamentos laboratoriais caros e especializados. Este trabalho apresenta a validação de um instrumento especializado projetado para processar rapidamente tecidos de casca ricos em floema de brotos cítricos, denominado extrator de tecido de madeira de brotação (BTE). O BTE aumenta o rendimento da amostra em 100% em comparação com os métodos atuais. Além disso, diminui a mão de obra e o custo dos equipamentos. Neste trabalho, as amostras de BTE apresentaram um rendimento de DNA (80,25 ng/μL) comparável ao protocolo de corte manual do CCPP (77,84 ng/μL). Este instrumento e o protocolo de processamento rápido de tecidos vegetais podem beneficiar vários laboratórios e programas de diagnóstico de citros na Califórnia e se tornar um sistema modelo para o processamento de tecidos para outras culturas lenhosas perenes em todo o mundo.

Introduction

Patógenos de citros transmissíveis por enxerto, como viróides, vírus e bactérias, têm causado epidemias devastadoras e sérias perdas econômicas em todas as áreas produtoras de citros do mundo. Os viróides dos citros são fatores limitantes de produção devido às exocortices e caquexias que causam em tipos de citros de importância econômica, como trifoliados, híbridos trifoliados, tangerinas, clementinas e tangerinas ^1,2,3. Na Califórnia, esses tipos de citros sensíveis a viróides são a base do crescente e lucrativo mercado de “easy-peelers”, seguindo a tendência de mudança na preferência dos consumidores por frutas fáceis de descascar, segmentadas e sem sementes ^4,5,6. Assim, os viróides dos citros são regulamentados pelo Departamento de Alimentação e Agricultura da Califórnia (CDFA) “Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senado Bill 140”, e os laboratórios do Plant Pest Diagnostics Branch da CDFA realizam milhares de testes de viróides dos citros anualmente 7,8,9,10 . O vírus da tristeza dos citros (CTV) foi responsável pela morte de mais de 100 milhões de citros desde o início da epidemia mundial na década de 1930 3,9,10,11. Na Califórnia, isolados do vírus representam uma séria ameaça para a indústria de citros californiana de US$ 3,6 bilhões^12,13,14. Consequentemente, a CDFA classifica o CTV como uma praga de planta de classe A regulamentada, e o laboratório da Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) realiza extensas pesquisas de campo e milhares de testes de vírus todos os anos^15,16. Estima-se que a bactéria “Candidatus Liberibacter asiaticus” (CLas) e a doença huanglongbing (HLB) tenham causado cerca de US$ 9 bilhões de danos econômicos à Flórida como resultado de uma redução de 40% da área cultivada com citros, uma diminuição de 57% nas operações de citros e uma perda de quase 8.000 empregos^17,18. Na Califórnia, uma hipotética redução de 20% na área cultivada com citros devido ao HLB foi prevista para resultar em mais de 8.200 perdas de empregos e uma redução de mais de meio bilhão de dólares no produto interno bruto do estado. Portanto, o Programa de Prevenção de Pragas e Doenças dos Citros gasta mais de US$ 40 milhões anualmente em pesquisas para testar, detectar e erradicar CLas da Califórnia^14,17,19,20.

Um elemento-chave do manejo de viróides, vírus e bactérias dos citros é o uso de materiais propagativos testados por patógenos (ou seja, madeira de brota) para a produção de árvores. A brota cítrica testada por patógenos é produzida e mantida dentro de programas quarentenários abrangentes que empregam técnicas avançadas de eliminação e detecção de patógenos^10,21. O Citrus Clonal Protection Program (CCPP) da Universidade da Califórnia, Riverside, testa milhares de amostras de budwood todos os anos de variedades cítricas recém-importadas para o estado e os EUA, bem como árvores de origem de budwood cítrico, para proteger os citros da Califórnia e apoiar as funções da National Clean Plant Network for Citrus^10,17,22. Para lidar com o grande volume de testes de citros, ensaios de detecção de patógenos de alto rendimento, confiáveis e custo-efetivos são um componente fundamental para o sucesso de programas como o CCPP ^7,10,22.

Embora ensaios de detecção de patógenos de base molecular, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), tenham permitido aumentos significativos no rendimento em laboratórios de diagnóstico de plantas, em nossa experiência, um dos gargalos mais críticos na implementação de protocolos de alto rendimento é a etapa de processamento de amostras de tecido vegetal. Isso é particularmente verdadeiro para os citros porque os protocolos atualmente disponíveis para o processamento de tecidos ricos em floema, como pecíolos foliares e cascas de brotas, são trabalhosos, demorados e requerem equipamentos laboratoriais caros e especializados. Esses protocolos requerem corte manual, pesagem, liofilização, moagem e centrifugação a baixas temperaturas para evitar a degradação do ácido nucleico 8,23,24. Por exemplo, no laboratório de diagnóstico CCPP, o processamento de amostras inclui (i) corte manual (6-9 amostras/h/operador), (ii) liofilização (16-24 h), (iii) pulverização (30-60 s) e (iv) centrifugação (1-2 h). O processo também requer suprimentos especializados (por exemplo, tubos de bloqueio de segurança para serviço pesado, bolas de moagem de aço inoxidável, adaptadores, lâminas, luvas) e várias peças de equipamentos de laboratório caros (por exemplo, freezer ultrabaixo, liofilizador, pulverizador de tecidos, crioestação de nitrogênio líquido, centrífuga refrigerada).

Como em qualquer indústria, a engenharia de equipamentos e a automação de processos são fundamentais para reduzir custos, aumentar o rendimento e fornecer produtos e serviços uniformes e de alta qualidade. A indústria de citros precisa de instrumentos de processamento de tecidos de baixo custo que exijam habilidade mínima para operar e, como tal, sejam fáceis de transferir para laboratórios de diagnóstico e operações de campo para permitir alta capacidade de processamento de amostras para detecção rápida de patógenos a jusante. A Technology Evolving Solutions (TES) e o CCPP desenvolveram (i.e., projetam e fabricam) e validaram (i.e., testados com amostras de citros e comparados com procedimentos laboratoriais padrão) um instrumento de baixo custo (i.e., eliminou a necessidade de equipamentos laboratoriais especializados) para o processamento rápido de tecidos cítricos ricos em floema (i.e., budwood), denominado extrator de tecido de budwood (BTE). Como visto na Figura 1, o BTE inclui um componente base para alimentação e controles, além de uma câmara removível para o processamento de brotos cítricos. A câmara BTE é composta por um rebolo projetado especificamente para retirar os tecidos da casca ricos em floema do broto cítrico. O tecido da casca triturada é ejetado rapidamente através de uma porta deslizante para uma seringa contendo tampão de extração, filtrado e preparado para extração e purificação de ácido nucleico sem qualquer manuseio ou preparação adicional (Figura 1). O sistema BTE também inclui um aplicativo de rastreamento de amostras sem papel e um aplicativo de pesagem integrado, que registram as informações de processamento de amostras em um banco de dados on-line em tempo real.

O sistema BTE aumentou a capacidade de diagnóstico laboratorial do CCPP em mais de 100% e tem consistentemente produzido extratos de tecido cítrico adequados para a purificação de ácidos nucleicos de alta qualidade e a detecção a jusante de patógenos transmissíveis por enxerto de citros usando ensaios de PCR. Mais especificamente, o BTE reduziu o tempo de processamento de tecidos de mais de 24 h para ~3 min por amostra, substituiu instrumentos de laboratório que custavam mais de US$ 60.000 (Figura 2, etapas 2-4) e permitiu o processamento de amostras maiores.

Este artigo apresenta os dados de processamento de tecido de casca de citros de alto rendimento BTE, extração de ácido nucleico e validação de detecção de patógenos com amostras de brotos cítricos de árvores de origem, incluindo todos os controles positivos e negativos apropriados da Instalação de Quarentena CCPP Rubidoux e da Instalação da Fundação Lindcove, respectivamente. Também apresentamos as mudanças de produtividade e tempo de processamento em comparação com o procedimento laboratorial atual (Figura 2). Além disso, este trabalho fornece um protocolo detalhado e passo a passo para laboratórios de testes de patógenos cítricos e demonstra como o BTE pode apoiar as funções de estoque de viveiro limpo de patógenos, levantamento e programas de erradicação.

Figura 1: Extrator de tecido de budwood. O BTE inclui um componente base para alimentação e controles, além de uma câmara removível para o processamento de brotos cítricos. A câmara BTE é composta por um rebolo projetado especificamente para retirar os tecidos da casca ricos em floema da madeira de brotos cítricos. O tecido da casca triturada é ejetado rapidamente através de uma porta deslizante para uma seringa, filtrado e preparado para extração e purificação de ácido nucleico sem qualquer manuseio ou preparação adicional. Abreviação: BTE = extrator de tecido de budwood. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Comparação passo a passo entre o procedimento convencional de laboratório de corte manual e o processamento de BTE. O processamento de BTE envolve processamento de tecido de casca de citros de alto rendimento, extração de ácido nucleico e detecção de patógenos. O tempo para cada etapa é indicado entre parênteses. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. Coleta das amostras de brotos cítricos para envio Envie à Technology Evolving Solutions uma planilha de informações de árvore para que eles carreguem em seu servidor web (eventualmente, o usuário criará novas árvores). Use o rastreador TES do aplicativo de telefone para selecionar uma árvore e mantenha uma etiqueta de coleira de comunicação de campo próximo (NFC) no telefone para carregar as informações da árvore na tag. Insira de três a q…

Representative Results

Extração, purificação e qualidade de RNA utilizando tecido cítrico de broto processado por BTE e avaliação do tempo de processamento tecidualForam utilizadas amostras de gema de 255 citros representativos para este teste para comparar a qualidade do RNA do BTE versus o procedimento padrão. As amostras foram processadas pelo extrator de tecido de budwood (BTE) (etapas do protocolo 4.1-4.6 e Figura 2, lado direito, passo 1, passo 5 e passo 6) ou preparadas seguindo o método de processamento de…

Discussion

Com o advento da doença dos citros do HLB, para reduzir as perdas, a indústria citrícola, as agências reguladoras e os laboratórios de diagnóstico têm sido instados a confiar em métodos de extração de ácido nucleico de alto rendimento combinados com processamento manual de amostras de baixo rendimento e ensaios de detecção de patógenos, como o qPCR³⁴ , para o teste de árvores individuais, em combinação com práticas de manejo de doenças³⁵. A taxa de positi…

Materials

0.08" Hex Trimmer line	PowerCare	FPRO07065	Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor	California Air Tools	8010	Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube	Globe Scientific	111558B	Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set	Technology Evolving Solutions	TE006-F1-10A-G1000-E1	Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach
12" Ruler	Westcott	‎16012	To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite	Hasa	1041	Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer	Insignia	NS-CZ70WH0	Store sample after processing
4" x 12" plastic bags	Plymor	FP20-4×12-10	Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab	Puritan	806-PCL	Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote	HDX	206152	Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun	JASTIND	‎JTABG103A	Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie	Sharpie	S-19421	Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor	Brand	Z627569	Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber	Technology Evolving Solutions	TE002BB-A05-E1	Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap	Dawn	57445CT	Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter	Air Science	P5-36XT-A	Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container	PolarTech	261/J50C	Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat	Red Kap	KP14WH LN 46	Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop	Microsoft	Surface	Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone	Samsung	Galaxy S9	Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Clip-E1	Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Collar-E1	Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves	Usa Scientific	3915-4400	Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff	3M	90565-4DC-PS	Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose	FYPower	‎510019	Attaches air gun to compressor
Saftey glasses	Solidwork	SW8329-US	Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle	JohnBee	B08QM81BJV	Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base	Technology Evolving Solutions	TE001-A-E1	System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale	Technology Evolving Solutions	TE003-A05-200g-01-E1	200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield
Vermiculite	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter	Boenfu	‎BOWC-06002-US	Wire cutters to cut trimmer line