Автоматизация переработки цитрусовых почек для последующего обнаружения патогенов с помощью приборостроения

Summary

Мы спроектировали, изготовили и валидировали инструмент, который быстро обрабатывает богатые флоэмой ткани коры цитрусовых. По сравнению с существующими методами, экстрактор тканей почки (BTE) увеличил пропускную способность образцов и снизил требуемые затраты на рабочую силу и оборудование.

Abstract

Трансмиссивные трансплантаты, ограниченные флоэмой патогены цитрусовых, такие как вирусы, вироиды и бактерии, ответственны за разрушительные эпидемии и серьезные экономические потери во всем мире. Например, вирус цитрусовых tristeza убил более 100 миллионов цитрусовых деревьев во всем мире, в то время как «Candidatus Liberibacter asiaticus» обошелся Флориде в 9 миллиардов долларов. Использование проверенных патогенами цитрусовых почек для размножения деревьев является ключом к борьбе с такими патогенами. Программа клональной защиты цитрусовых (CCPP) в Калифорнийском университете в Риверсайде использует полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для тестирования тысяч образцов цитрусовых почковых деревьев каждый год, чтобы защитить цитрусовые цитрусовые в Калифорнии и предоставить чистые устройства для размножения Национальной сети чистых растений. Серьезным узким местом в высокопроизводительном молекулярном обнаружении вирусов цитрусовых и вироидов является этап обработки растительных тканей.

Надлежащая подготовка тканей имеет решающее значение для извлечения качественных нуклеиновых кислот и последующего использования в ПЦР-анализах. Измельчение, взвешивание, сублимационная сушка, измельчение и центрифугирование растительных тканей при низких температурах во избежание разложения нуклеиновых кислот является трудоемким процессом и требует дорогостоящего и специализированного лабораторного оборудования. В данной статье представлена валидация специализированного прибора, разработанного для быстрой обработки богатых флоэмой тканей коры цитрусовых почек, названного экстрактором тканей почек (BTE). Заушная заушка увеличивает пропускную способность на 100% по сравнению с существующими методами. Кроме того, это снижает трудозатраты и стоимость оборудования. В этой работе заушные образцы имели выход ДНК (80,25 нг/мкл), который был сопоставим с протоколом ручного измельчения CCPP (77,84 нг/мкл). Этот инструмент и протокол быстрой обработки тканей растений могут принести пользу нескольким лабораториям и программам диагностики цитрусовых в Калифорнии и стать моделью системы обработки тканей для других древесных многолетних культур во всем мире.

Introduction

Трансплантатные патогены цитрусовых, ограниченные флоэмой, такие как вироиды, вирусы и бактерии, вызвали разрушительные эпидемии и серьезные экономические потери во всех регионах мира, производящих цитрусовые. Цитрусовые вироиды являются ограничивающими факторами производства из-за болезней экзокортиса и кахексии, которые они вызывают у экономически важных видов цитрусовых, таких как тройчатые, трехлистные гибриды, мандарины, клементины и мандарины ^1,2,3. В Калифорнии эти чувствительные к вироидам виды цитрусовых являются основой растущего и прибыльного рынка «легких очистителей», следуя меняющейся тенденции в предпочтениях потребителей к фруктам, которые легко очищаются от кожуры, сегментированы и не содержат косточек ^4,5,6. Таким образом, вироиды цитрусовых регулируются в соответствии с Программой чистоты вредителей Сената 140 Департамента продовольствия и сельского хозяйства Калифорнии (CDFA), а лаборатории Отдела диагностики вредителей растений CDFA ежегодно проводят тысячи тестов на вироиды цитрусовых 7,8,9,10 . Вирус цитрусовых тристеза (CTV) стал причиной гибели более 100 миллионов цитрусовых деревьев с начала глобальной эпидемии в 1930-х годах: 3,9,10,11. В Калифорнии изоляты вируса, вызывающие точечную коррозию стеблей и разрыв тройчатых слоев, представляют серьезную угрозу для калифорнийской цитрусовой промышленности стоимостью 3,6 миллиарда долларов 12,13,14. Следовательно, CDFA классифицирует CTV как регулируемый вредитель растений класса А, а лаборатория Агентства по искоренению тристезы в Центральной Калифорнии (CCTEA) ежегодно проводит обширные полевые исследования и тысячи тестов на ^{вирусы.} Бактерия “Candidatus Liberibacter asiaticus” (CLas) и болезнь хуанлунбин (HLB), по оценкам, нанесли экономический ущерб Флориде на сумму около 9 миллиардов долларов в результате сокращения посевных площадей цитрусовых на 40%, сокращения производства цитрусовых на 57% и потери почти 8000^{рабочих мест.} В Калифорнии гипотетическое сокращение посевных площадей цитрусовых на 20% из-за ГЛБ, по прогнозам, приведет к потере более 8200 рабочих мест и сокращению валового внутреннего продукта штата более чем на полмиллиарда долларов. Таким образом, Программа профилактики вредителей и болезней цитрусовых ежегодно тратит более 40 миллионов долларов на исследования по тестированию, выявлению и искоренению CLas в Калифорнии^14,17,19,20.

Ключевым элементом борьбы с вироидами, вирусами и бактериями цитрусовых является использование для выращивания деревьев проверенных патогенами материалов для размножения (например, бутонов). Цитрусовые почки, проверенные на патогены, выращиваются и поддерживаются в рамках комплексных карантинных программ, в которых используются передовые методы уничтожения и обнаружения патогенов^10,21. Программа защиты клональных пород цитрусовых (CCPP) в Калифорнийском университете в Риверсайде ежегодно тестирует тысячи образцов почек из сортов цитрусовых, недавно импортированных в штат и США, а также исходных деревьев цитрусовых, чтобы защитить цитрусовые цитрусовые и поддержать функции Национальной сети чистых растений для цитрусовых^10,17,22. Для обработки больших объемов тестирования цитрусовых высокопроизводительные, надежные и экономичные анализы для обнаружения патогенов являются фундаментальным компонентом успеха таких программ, как CCPP ^7,10,22.

В то время как молекулярные методы обнаружения патогенов, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволили значительно увеличить пропускную способность лабораторий по диагностике растений, по нашему опыту, одним из наиболее критических узких мест при внедрении высокопроизводительных протоколов является этап обработки образцов растительных тканей. Это особенно актуально для цитрусовых, поскольку доступные в настоящее время протоколы обработки богатых флоэмой тканей, таких как черешки листьев и кора почек, являются трудоемкими, длительными и требуют дорогостоящего и специализированного лабораторного оборудования. Эти протоколы требуют ручного измельчения, взвешивания, сублимационной сушки, измельчения и центрифугирования при низких температурах, чтобы избежать разложения нуклеиновых кислот 8,23,24. Например, в диагностической лаборатории CCPP обработка проб включает в себя (i) ручное измельчение (6-9 проб/ч на оператора), (ii) сублимационную сушку (16-24 ч), (iii) измельчение (30-60 с) и (iv) центрифугирование (1-2 ч). Этот процесс также требует специализированных расходных материалов (например, сверхпрочных трубок с предохранительным замком, мелющих шаров из нержавеющей стали, адаптеров, лезвий, перчаток) и нескольких единиц дорогостоящего лабораторного оборудования (например, морозильной камеры со сверхнизкой температурой, сублимационной сушилки, измельчителя тканей, криостанции жидкого азота, охлаждаемой центрифуги).

Как и в любой отрасли, проектирование оборудования и автоматизация процессов являются ключом к снижению затрат, увеличению производительности и обеспечению высококачественных, однородных продуктов и услуг. Цитрусовая промышленность нуждается в недорогих инструментах для обработки тканей, которые требуют минимальных навыков для работы и, как таковые, легко переносятся в диагностические лаборатории и полевые операции, чтобы обеспечить высокую производительность обработки образцов для быстрого обнаружения патогенов. Technology Evolving Solutions (TES) и CCPP разработали (т.е. спроектировали и изготовили) и валидировали (т.е. протестировали на образцах цитрусовых и сравнили со стандартными лабораторными процедурами) недорогой (т.е. устранил необходимость в специализированном лабораторном оборудовании) прибор для быстрой обработки богатых флоэмой тканей цитрусовых (т.е. бутонов), названный экстрактором тканей бутонов (BTE). Как видно на рисунке 1, BTE включает в себя базовый компонент для питания и управления, а также съемную камеру для обработки цитрусовых бутонов. Заушная камера состоит из шлифовального круга, специально разработанного для удаления богатых флоэмой тканей коры с цитрусовых почек. Измельченная ткань коры быстро выталкивается через скользящее отверстие в шприц, содержащий буфер для экстракции, фильтруется и готовится к экстракции и очистке нуклеиновых кислот без какой-либо дополнительной обработки или подготовки (рисунок 1). Система BTE также включает в себя безбумажное приложение для отслеживания образцов и интегрированное приложение для взвешивания, которые записывают информацию об обработке образца в онлайн-базу данных в режиме реального времени.

Система BTE увеличила возможности лабораторной диагностики CCPP более чем на 100% и обеспечивает стабильное производство экстрактов тканей цитрусовых, подходящих для очистки высококачественных нуклеиновых кислот и последующего обнаружения трансплантатных патогенов цитрусовых с помощью ПЦР-анализов. В частности, BTE сократила время обработки тканей с более чем 24 часов до ~3 минут на образец, заменила лабораторные инструменты стоимостью более 60 000 долларов США (рис. 2, шаги 2-4) и позволила обрабатывать образцы большего размера.

В этом документе представлены данные о высокопроизводительной обработке тканей коры цитрусовых, экстракции нуклеиновых кислот и валидации обнаружения патогенов с образцами цитрусовых почек с исходных деревьев, включая все соответствующие положительные и отрицательные контрольные данные карантинного центра CCPP Rubidoux и Фонда Lindcove, соответственно. Мы также представляем изменения производительности и времени обработки по сравнению с текущей лабораторной процедурой (рис. 2). Кроме того, в этой работе представлен подробный, пошаговый протокол для лабораторий по тестированию на патогены цитрусовых и показано, как BTE может поддерживать функции чистого от патогенов питомника, программ обследования и уничтожения.

Рисунок 1: Экстрактор тканей Budwood. Заушная труба включает в себя базовый компонент для питания и управления, а также съемную камеру для обработки цитрусовых бутонов. Заушная камера состоит из шлифовального круга, специально разработанного для удаления богатых флоэмой тканей коры цитрусовых почек. Измельченная ткань коры быстро выталкивается через скользящее отверстие в шприц, фильтруется и готовится к экстракции и очистке нуклеиновых кислот без каких-либо дополнительных манипуляций или подготовки. Аббревиатура: BTE = экстрактор тканей из бутонов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Пошаговое сравнение между традиционной лабораторной процедурой ручного измельчения и заушной обработкой. Заушная обработка включает в себя высокопроизводительную обработку тканей коры цитрусовых, экстракцию нуклеиновых кислот и обнаружение патогенов. В скобках указано время каждого шага. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

1. Сбор образцов цитрусовых почек для отправки Отправьте Technology Evolving Solutions электронную таблицу с информацией о деревьях, чтобы они загрузили ее на свой веб-сервер (в конечном итоге пользователь создаст новые деревья). Используйте трекер TES в приложении для тел…

Representative Results

Экстракция, очистка и качество РНК с использованием тканей цитрусовых, обработанных заушными бутонами, и оценка времени обработки тканейДля этого теста мы использовали образцы почковой древесины из 255 репрезентативных цитрусовых деревьев, чтобы сравнить качество РНК из за…

Discussion

С появлением ГЛБ цитрусовых для сокращения потерь цитрусовая промышленность, регулирующие органы и диагностические лаборатории были призваны полагаться на высокопроизводительные методы экстракции нуклеиновых кислот в сочетании с малопроизводительной ручной обработкой образцов и …

Materials

0.08" Hex Trimmer line	PowerCare	FPRO07065	Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor	California Air Tools	8010	Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube	Globe Scientific	111558B	Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set	Technology Evolving Solutions	TE006-F1-10A-G1000-E1	Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach
12" Ruler	Westcott	‎16012	To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite	Hasa	1041	Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer	Insignia	NS-CZ70WH0	Store sample after processing
4" x 12" plastic bags	Plymor	FP20-4×12-10	Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab	Puritan	806-PCL	Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote	HDX	206152	Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun	JASTIND	‎JTABG103A	Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie	Sharpie	S-19421	Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor	Brand	Z627569	Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber	Technology Evolving Solutions	TE002BB-A05-E1	Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap	Dawn	57445CT	Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter	Air Science	P5-36XT-A	Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container	PolarTech	261/J50C	Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat	Red Kap	KP14WH LN 46	Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop	Microsoft	Surface	Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone	Samsung	Galaxy S9	Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Clip-E1	Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Collar-E1	Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves	Usa Scientific	3915-4400	Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff	3M	90565-4DC-PS	Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose	FYPower	‎510019	Attaches air gun to compressor
Saftey glasses	Solidwork	SW8329-US	Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle	JohnBee	B08QM81BJV	Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base	Technology Evolving Solutions	TE001-A-E1	System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale	Technology Evolving Solutions	TE003-A05-200g-01-E1	200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield
Vermiculite	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter	Boenfu	‎BOWC-06002-US	Wire cutters to cut trimmer line