Automatisering af citrusknoptræbehandling til nedstrøms patogendetektion gennem instrumentteknik

Summary

Vi konstruerede, fremstillede og validerede et instrument, der hurtigt behandler floemrig bark citrus budwood væv. Sammenlignet med nuværende metoder har knoptrævævsekstraktoren (BTE) øget prøvegennemstrømningen og reduceret de krævede arbejds- og udstyrsomkostninger.

Abstract

Graft-overførbare, phloem-begrænsede patogener af citrus såsom vira, viroider og bakterier er ansvarlige for ødelæggende epidemier og alvorlige økonomiske tab over hele verden. For eksempel dræbte citrustristeza-viruset over 100 millioner citrustræer globalt, mens “Candidatus Liberibacter asiaticus” har kostet Florida 9 milliarder dollars. Anvendelsen af patogentestet citrusknopved til træformering er nøglen til forvaltningen af sådanne patogener. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) ved University of California, Riverside, bruger polymerasekædereaktion (PCR) assays til at teste tusindvis af prøver fra citrusknoptræ kildetræer hvert år for at beskytte Californiens citrus og for at levere rene formeringsenheder til National Clean Plant Network. En alvorlig flaskehals i den molekylære påvisning af citrusvirus og viroider med høj kapacitet er plantevævsbehandlingstrinnet.

Korrekt vævsforberedelse er afgørende for ekstraktion af nukleinsyrer af høj kvalitet og downstream-anvendelse i PCR-assays. Hakning, vejning, frysetørring, slibning og centrifugering af plantevæv ved lave temperaturer for at undgå nedbrydning af nukleinsyre er tidskrævende og arbejdskrævende og kræver dyrt og specialiseret laboratorieudstyr. Dette papir præsenterer valideringen af et specialiseret instrument konstrueret til hurtigt at behandle floemrige barkvæv fra citrusknopved, kaldet budwoodvævsekstraktoren (BTE). BTE øger prøvegennemstrømningen med 100 % sammenlignet med de nuværende metoder. Derudover reducerer det arbejdskraft og omkostningerne ved udstyr. I dette arbejde havde BTE-prøverne et DNA-udbytte (80,25 ng/μL), der var sammenligneligt med CCPP’s håndhuggeprotokol (77,84 ng/μL). Dette instrument og protokollen for hurtig plantevævsbehandling kan gavne flere citrusdiagnostiske laboratorier og programmer i Californien og blive et modelsystem til vævsbehandling til andre træagtige flerårige afgrøder over hele verden.

Introduction

Graft-overførbare phloem-begrænsede patogener af citrus, såsom viroider, vira og bakterier, har forårsaget ødelæggende epidemier og alvorlige økonomiske tab i alle citrusproducerende områder i verden. Citrusviroider begrænser produktionsfaktorer på grund af de exocortis og kakeksi sygdomme, de forårsager i økonomisk vigtige citrustyper, såsom trifoliate, trifoliate hybrider, mandariner, klementiner og mandariner ^1,2,3. I Californien er disse viroidfølsomme citrustyper grundlaget for det voksende og rentable marked for “easy-peelers”, der følger den skiftende tendens i forbrugernes præference for frugter, der er lette at skrælle, segmenteret og frøfri ^4,5,6. Således reguleres citrusviroider under California Department of Food and Agriculture (CDFA) “Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senate Bill 140”, og laboratorierne i CDFA’s Plant Pest Diagnostics Branch udfører tusindvis af citrusviroidtest årligt 7,8,9,10 . Citrus tristeza virus (CTV) har været ansvarlig for døden af over 100 millioner citrustræer siden begyndelsen af den globale epidemi i 1930’erne 3,9,10,11. I Californien udgør stammegruber og trifoliatbrydende resistensisolater af virussen en alvorlig trussel mod den californiske citrusindustri på 3,6 milliarder dollars^12,13,14. Derfor klassificerer CDFA CTV som en reguleret klasse A plante skadedyr, og laboratoriet i Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) udfører omfattende feltundersøgelser og tusindvis af virustest hvert år^15,16. Bakterien “Candidatus Liberibacter asiaticus” (CLas) og huanglongbing (HLB) sygdommen anslås at have forårsaget tæt på 9 milliarder dollars økonomisk skade på Florida som følge af en 40% reduktion af citrusareal, et fald på 57% i citrusoperationer og et tab på næsten 8.000 job^17,18. I Californien blev en hypotetisk reduktion på 20% i citrusareal på grund af HLB forudsagt at resultere i mere end 8.200 tab af arbejdspladser og en reduktion på over en halv milliard dollars i statens bruttonationalprodukt. Derfor bruger Citrus Pest and Disease Prevention Program over 40 millioner dollars årligt på undersøgelser for at teste, opdage og udrydde CLas fra Californien^14,17,19,20.

Et nøgleelement i forvaltningen af citrusviroider, vira og bakterier er brugen af patogentestede formeringsmaterialer (dvs. knoptræ) til træproduktion. Patogentestet citrusknoptræ produceres og vedligeholdes inden for omfattende karantæneprogrammer, der anvender avancerede patogeneliminerings- og detektionsteknikker^10,21. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) ved University of California, Riverside, tester tusindvis af knoptræprøver hvert år fra citrussorter, der nyligt importeres til staten og USA, samt citrusknoptrækildetræer for at beskytte Californiens citrus og understøtte funktionerne i National Clean Plant Network for Citrus^10,17,22. For at håndtere den store mængde citrustest er pålidelige og omkostningseffektive patogendetektionsassays med høj gennemstrømning en grundlæggende komponent for succes med programmer som CCPP ^7,10,22.

Mens molekylærbaserede patogendetektionsassays såsom polymerasekædereaktion (PCR) har muliggjort betydelige stigninger i gennemstrømningen i plantediagnostiske laboratorier, er det vores erfaring, at en af de mest kritiske flaskehalse i implementeringen af protokoller med høj gennemstrømning er behandlingstrinnet for plantevævsprøver. Dette gælder især for citrus, fordi de aktuelt tilgængelige protokoller til behandling af floemrige væv såsom bladblade og knopbark er arbejdskrævende, tidskrævende og kræver dyrt og specialiseret laboratorieudstyr. Disse protokoller kræver håndhakning, vejning, frysetørring, slibning og centrifugering ved lave temperaturer for at undgå nedbrydning af nukleinsyre 8,23,24. For eksempel omfatter prøvebehandling på CCPP-diagnoselaboratoriet (i) håndhakning (6-9 prøver / h / operatør), (ii) frysetørring (16-24 timer), iii) pulverisering (30-60 s) og (iv) centrifugering (1-2 timer). Processen kræver også specialiserede forsyninger (f.eks. kraftige safe-lock-rør, slibekugler i rustfrit stål, adaptere, knive, handsker) og flere stykker dyrt laboratorieudstyr (f.eks. ultra-lav fryser, frysetørrer, vævspulverisator, flydende nitrogenkryostation, kølecentrifuge).

Som i enhver branche er udstyrsteknik og automatisering af processer nøglen til at sænke omkostningerne, øge gennemstrømningen og levere ensartede produkter og tjenester af høj kvalitet. Citrusindustrien har brug for billige vævsbehandlingsinstrumenter, der kræver et minimum af færdigheder for at fungere, og som sådan er lette at overføre til diagnostiske laboratorier og feltoperationer for at muliggøre høj prøvebehandlingskapacitet til hurtig nedstrøms patogendetektion. Technology Evolving Solutions (TES) og CCPP udviklede (dvs. design og fabrikation) og validerede (dvs. testet med citrusprøver og sammenlignet med standard laboratorieprocedurer) et billigt (dvs. elimineret behovet for specialiseret laboratorieudstyr) instrument til hurtig behandling af floemrige citrusvæv (dvs. budwood), kaldet budwood tissue extractor (BTE). Som det fremgår af figur 1, indeholder BTE en basiskomponent til strøm og styring samt et aftageligt kammer til forarbejdning af citrusknopved. BTE-kammeret består af et slibehjul, der er specielt designet til at fjerne det floemrige barkvæv fra citrusknopved. Det strimlede barkvæv skubbes hurtigt ud gennem en glideport ind i en sprøjte indeholdende ekstraktionsbuffer, filtreres og gøres klar til nukleinsyreekstraktion og oprensning uden yderligere håndtering eller forberedelse (figur 1). BTE-systemet omfatter også en papirløs prøvesporingsapplikation og en integreret vejeapplikation, der registrerer prøvebehandlingsoplysningerne i en online database i realtid.

BTE-systemet har øget CCPP’s laboratoriediagnostiske kapacitet med over 100 % og har konsekvent fremstillet citrusvævsekstrakter, der er egnede til oprensning af nukleinsyrer af høj kvalitet og nedstrøms påvisning af transplantatoverførbare patogener af citrusfrugter ved hjælp af PCR-assays. Mere specifikt har BTE reduceret tiden til vævsbehandling fra over 24 timer til ~ 3 minutter pr. prøve, erstattet laboratorieinstrumenter, der koster over $ 60,000 (figur 2, trin 2-4) og tilladt behandling af større prøvestørrelser.

Dette papir præsenterer BTE-citrusbarkvævsbehandling med høj kapacitet, nukleinsyreekstraktion og validering af patogendetektion med citrusknoptræprøver fra kildetræer, herunder alle de relevante positive og negative kontroller fra henholdsvis CCPP Rubidoux Quarantine Facility og Lindcove Foundation Facility. Vi viser også ændringer i gennemløb og behandlingstid sammenlignet med den aktuelle laboratorieprocedure (figur 2). Derudover giver dette arbejde en detaljeret, trinvis protokol til citruspatogentestlaboratorier og demonstrerer, hvordan BTE kan understøtte funktionerne i patogen-rene planteskolebestand, undersøgelse og udryddelsesprogrammer.

Figur 1: Knoptræ vævsekstraktor. BTE indeholder en basiskomponent til strøm og styring samt et aftageligt kammer til behandling af citrusknoptræ. BTE-kammeret består af en slibeskive, der er specielt designet til at fjerne det floemrige barkvæv fra citrusknopved. Det strimlede barkvæv skubbes hurtigt ud gennem en glideport i en sprøjte, filtreres og gøres klar til nukleinsyreekstraktion og oprensning uden yderligere håndtering eller forberedelse. Forkortelse: BTE = knoptræ vævsekstraktor. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Trin-for-trin sammenligning mellem den konventionelle håndhakkende laboratorieprocedure og BTE-behandling. BTE-behandling involverer citrusbarkvævsbehandling med høj kapacitet, nukleinsyreekstraktion og patogendetektion. Tiden for hvert trin er angivet i parentes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Indsamling af citrusknoptræprøverne til afsendelse Send Technology Evolving Solutions et regneark med træoplysninger, som de kan indlæse på deres webserver (til sidst opretter brugeren nye træer). Brug telefonappens TES-tracker til at vælge et træ, og hold et NFC-halsbåndsmærke (Near Field Communication) på telefonen for at indlæse træoplysningerne i tagget. Indsæt tre til fire citrusknoptræprøver i den BTE-kompatible plastikposeholder, og…

Representative Results

RNA-ekstraktion, oprensning og kvalitet ved hjælp af BTE-behandlet knoptræ citrusvæv og vurdering af tid til vævsbehandlingVi brugte knoptræprøver fra 255 repræsentative citrustræer til denne test for at sammenligne RNA-kvaliteten fra BTE versus standardproceduren. Prøverne blev behandlet af knoptrævævsekstraktoren (BTE) (protokoltrin 4.1-4.6 og figur 2, højre side, trin 1, trin 5 og trin 6) eller fremstillet efter den lovgivningsmæssigt godkendte citrusknoptrævævsbehandlingsmetode, de…

Discussion

Med fremkomsten af HLB-citrussygdom er citrusindustrien, reguleringsagenturer og diagnostiske laboratorier for at reducere tab blevet opfordret til at stole på nukleinsyreekstraktionsmetoder med høj kapacitet kombineret med manuel prøvebehandling med lav kapacitet og patogendetektionsassays såsom qPCR³⁴ til testning af individuelle træer i kombination med sygdomshåndteringspraksis³⁵. Californiens HLB-positivitetsrate er gået fra 0,01% i 2012 til 1,2% i 2020. Selv om …

Materials

0.08" Hex Trimmer line	PowerCare	FPRO07065	Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor	California Air Tools	8010	Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube	Globe Scientific	111558B	Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set	Technology Evolving Solutions	TE006-F1-10A-G1000-E1	Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach
12" Ruler	Westcott	‎16012	To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite	Hasa	1041	Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer	Insignia	NS-CZ70WH0	Store sample after processing
4" x 12" plastic bags	Plymor	FP20-4×12-10	Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab	Puritan	806-PCL	Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote	HDX	206152	Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun	JASTIND	‎JTABG103A	Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie	Sharpie	S-19421	Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor	Brand	Z627569	Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber	Technology Evolving Solutions	TE002BB-A05-E1	Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap	Dawn	57445CT	Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter	Air Science	P5-36XT-A	Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container	PolarTech	261/J50C	Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat	Red Kap	KP14WH LN 46	Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop	Microsoft	Surface	Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone	Samsung	Galaxy S9	Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Clip-E1	Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Collar-E1	Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves	Usa Scientific	3915-4400	Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff	3M	90565-4DC-PS	Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose	FYPower	‎510019	Attaches air gun to compressor
Saftey glasses	Solidwork	SW8329-US	Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle	JohnBee	B08QM81BJV	Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base	Technology Evolving Solutions	TE001-A-E1	System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale	Technology Evolving Solutions	TE003-A05-200g-01-E1	200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield
Vermiculite	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter	Boenfu	‎BOWC-06002-US	Wire cutters to cut trimmer line